技術領域

本發明涉及生物技術領域，為一種利用誘導子提高反應器培養東北刺人參不定根中有效物質的方法。

背景技術

東北刺人參(Oplopanax elatus Nakai)又名刺參，五加科刺參屬，多年生落葉灌木，是我國長白山特有的植物資源之一。東北刺人參藥用價值極高，其根、根莖和莖是名貴的中藥材，富含皂苷、多糖、黃酮、揮發油、蒽醌、脂肪酸等多種藥用成分，可用于治療神經衰弱、低血壓、陽萎、精神分裂、糖尿病等疾病，并具有抗真菌、抗抑郁、解熱、鎮痛和抗衰老的作用。近年來又發現葉中含有的一些成分與根和莖相近，所以葉也具有藥用價值。由于其療效顯著，且無任何毒副作用，在長白山區被稱作“木本人參”。目前，對東北刺人參化學成分及藥理作用的研究較多，但臨床應用研究則較少，因此開發及研制東北刺人參高效藥物，對東北刺人參資源的利用具有重要意義。由于其藥用價值很高，人們過度采挖導致其野生資源短缺，人工栽培方面，有性繁殖，結實率低，移栽成活率低；無性繁殖出現假死現象，且恢復期生長期長，繁殖材料來源短缺，在栽培過程中易受氣候和化學農藥的影響，產量不能保持穩定，具有較大風險，因此尋找一種可以替代野生及人工栽培東北刺人參的方法已迫在眉睫，而利用植物組織培養進行中藥資源繁殖并大規模生產已成為一條有效可行的發展途徑，植物組織培養包括細胞培養，組織和器官培養，但藥用植物細胞培養的弊端之一是有效成分含量不穩定，這主要是由于大多數有效成分均為次生代謝產物，其合成在細胞階段表現不強而造成，而根培養可以解決這一問題。

不定根培養的優勢在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成能力，根培養中細胞的高度分化使得次生代謝產物的合成能力明顯提高，同時表現出明顯的代謝穩定性和活力穩定性，加之與生物反應器的結合利用，使得東北刺人參不定根的大量生產得到了有效的保證，進而為東北刺人參野生資源的保護及開發提供了一條有效可行的方法。由于生產黃酮及多糖含量高且穩定的東北刺人參不定根在藥物開發中極為重要，近年來，利用誘導子進行目標產物調控及生物合成已得到越來越多的國內外學者的關注，也是大幅度提高培養物中代謝產物的重要方法之一。

誘導子包括生物誘導子和非生物誘導子兩大類，它具有專一性、快速性、濃度效應、時間效應以及協同效應，同一植物對不同誘導子的反應不同，因而刺激合成的代謝產物及其含量也有所不同，因此，在實際應用中應綜合考慮與靈活運用，使誘導子在藥用植物培養過程中發揮最佳促進作用。本發明選用三種非生物誘導子(茉莉酸甲酯、水楊酸、普魯蘭多糖)處理反應器培養的東北刺人參不定根，發現三種誘導子對東北刺人參不定根中黃酮含量均有大幅度提高，茉莉酸甲酯和普魯蘭多糖誘導子對不定根中多糖含量的積累也有明顯促進作用，這對東北刺人參資源的開發利用有十分重要意義。

本發明利用氣球型氣升式生物反應器培養東北刺人參不定根，當不定根生物量達到最大時(培養30～40d)加入三種誘導子，處理10d，發現這三種誘導子處理后對不定根生物量影響不大，且促進不定根中黃酮的合成，使其含量得到顯著提高；同時，利用茉莉酸甲酯和普魯蘭多糖作為誘導子可以提高東北刺人參不定根中多糖含量及生產量。該方法通過對反應器內不定根培養可在短時間內獲得較高含量的東北刺人參黃酮及多糖，獲得的高效代謝產物東北刺人參不定根對珍稀東北刺人參的資源利用與開發保護意義重大。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用誘導子提高反應器培養東北刺人參不定根中有效物質的方法。以反應器培養的東北刺人參不定根為材料，用茉莉酸甲酯、水楊酸及普魯蘭多糖對不定根進行處理，通過對三種誘導子濃度的篩選，制定提高東北刺人參中黃酮及多糖含量的具體方案，為珍稀東北刺人參資源的保護和開發利用提供一種新方法。

本發明采用了以下技術方案：

一種利用誘導子提高反應器培養東北刺人參不定根中有效物質的方法。

①東北刺人參不定根誘導和反應器培養

將東北刺人參無菌苗側根誘導的不定根進行增殖，增殖獲得的不定根稱取20g(FW)接種于含有4L液體培養基的5L氣球型氣升式生物反應器中，通氣量為300mL/min，溫度為25℃條件下暗培養。

②誘導子處理

當反應器培養30～40d不定根生物量達到最大時(120～150g/L鮮物重)，收獲反應器內不定根并收集培養液，稱取10g不定根接種于含有100mL上述培養基的的三角瓶中，同時添加三種不同濃度的誘導子進行處理，10d后收獲不定根，然后測定其生物量。

③東北刺人參不定根中黃酮含量及生產量的測定