技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，涉及一種動物病原微生物假病毒載體的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

二十世紀末，Pasloske等人提出了一種新的RNA質(zhì)控品制備技術(shù)，即裝甲RNA(Armored?RNA)技術(shù)(Pasloske?B?L，et?al.Armored?RNAtechnology?for?production?of?ribonuclease-resistant?viral?RNA?controls?and?standards[J].J?Clin?Microbiol，1998，36(12)：3590-3594；W?alker?Peach?C?R，et?al.Ribonuclease?resistant?RNA?controls(Armored?RNA)for?reverse?transcription-PCR，branched?DNA，and?genotyping?assays?for?hepatitis?C?virus[J].Clin?Chem，1999，45(12)：2079-2085)。該技術(shù)解決了傳統(tǒng)RNA質(zhì)控品存在的問題(或者穩(wěn)定性差，或存在生物傳染隱患，或達不到監(jiān)測核酸提取及反轉(zhuǎn)錄過程的目的等)。裝甲RNA技術(shù)的原理是將包含有大腸桿菌MS2噬菌體的外殼蛋白基因的序列及外源基因克隆到表達載體中，這一載體能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)錄成RNA，并利用載體上MS2的外殼蛋白編碼基因組裝的外殼蛋白將其裝配成球狀RNA病毒結(jié)構(gòu)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，我們稱之為裝甲RNA假病毒顆粒。

目前構(gòu)建假病毒顆粒的常用假病毒載體主要由可以編碼MS2噬菌體外殼蛋白的基因序列和具有高效表達的表達載體組成。MS2噬菌體是單鏈正性RNA病毒，為26nm長的20面體，包含有3個基因，編碼成熟酶蛋白、外殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白4種蛋白質(zhì)分子。噬菌體由180個外殼蛋白單體、一分子成熟酶蛋白和一分子基因組RNA組成。每個MS2噬菌體是含有180個拷貝的外殼蛋白，一拷貝的成熟酶蛋白，包裹一分子RNA的正二十面體(賈盤興.噬菌體分子生物學(xué)-基木知識和技能[M].北京：科學(xué)出版社，2001，2-5)。在早期噬菌體的研究中發(fā)現(xiàn)，噬菌體復(fù)制酶基因的5’端有一個約21個核苷酸組成的莖-環(huán)區(qū)域(操縱子或pac位點)，噬菌體外殼蛋白的二聚體與這個莖環(huán)結(jié)構(gòu)的結(jié)合不但引發(fā)了外殼蛋白本身的組裝，而且還引發(fā)了外殼蛋白包裹整個噬菌體基因組RNA的過程(Peabody?DS.The?RNAbinding?site?of?bacteriophage?MS2?coat?protein.EMBO?J，1993，12(2)：595-600；Peabody?DS.Role?of?the?coat?protein-RNA?interaction?in?the?life?cycle?of?bacteriophage?MS2.Mol?Gen?Genet，1997，254(4)：358-364)。MS2噬菌體成熟酶蛋白可與噬菌體RNA的兩個位點發(fā)生作用。這種相互作用不是噬菌體包裝過程所必須的，但是在噬菌體顆粒中這種相互作用可以用來保護基因組RNA不被廣泛存在的核糖核酸酶消化(Shiba?T，Suzuki?Y.Localization?of?A?protein?in?the?RNA-Aprotein?complex?of?RNA?phage?MS2.Biochim?Biophys?Acta.1981，654(2)：249-255.)研究表明MS2噬菌體成熟酶蛋白對噬菌體外殼的包裝起重要作用(Kuzmanovic?DA，Elashvili?l，Wick?C，et?al.The?MS2Coat?Protein?Shell?is?Likely?assembled?Under?Tension：a?novel?role?for?the?MS2?Bacteriophage?A?Protein?as?revealed?by?small-angle?neutron?scattering[J].J?Mol?Biol，2006，355(5)：1095-1111)。裂解蛋白和復(fù)制酶蛋白不是噬菌體顆粒的組成部分。裂解蛋白的作用是裂解大腸桿菌細胞從而釋放出病毒顆粒。復(fù)制酶蛋白的作用是與其它3個大腸桿菌宿主蛋白組成一個蛋白復(fù)合體，這個蛋白復(fù)合體負責基因組RNA的復(fù)制和合成。在MS2噬菌體外殼蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)外殼蛋白與噬菌體復(fù)制酶5′端由19個堿基(19mer)組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA序列有特異性相互作用，這種作用可引發(fā)噬菌體外殼的組裝，同時又將噬菌體基因組RNA包裝到包膜內(nèi)。研究人員發(fā)現(xiàn)在包裝位點后引入非噬菌體基因序列也可以引發(fā)包裝。因此，如果將外源基因克隆于MS2噬菌體外殼蛋白基因編碼序列下游，并在其下游插入終止子，轉(zhuǎn)錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的外源基因RNA轉(zhuǎn)錄本，誘導(dǎo)表達過程中噬菌體外殼蛋白得以表達并組裝成蛋白外殼，并將攜帶有外源基因的噬菌體基因組包裹到包膜內(nèi)，構(gòu)成噬菌體病毒樣顆粒。由于單獨表達的外殼蛋白組裝過程不成熟，不能得到耐RNase的病毒包膜，研究者將MS2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因編碼序列以及其基因組部分包含基因調(diào)節(jié)元件序列的5′非編碼序列相應(yīng)的cDNA序列都連接到表達載體啟動子下游，經(jīng)過誘導(dǎo)表達得到成熟酶蛋白和外殼蛋白，在成熟酶以及噬菌體基因組RNA的協(xié)同作用下，外殼蛋白可組裝為成熟的假病毒顆粒外殼，并具有耐RNase作用的特性。