[發明專利]一種提取及培養間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201210488783.3
• 申請日: 2012-11-27
• 公開（公告）號: CN103060269A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 王泰華;李榮榮;孫濤
• 申請（專利權）人: 山東新醫學中西醫結合醫學研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是指一種提取及培養間充質干細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞最初在骨髓中發現，目前已經可以從多種組織中分離出間充質干細胞，包括骨膜、松質骨、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中等，因其具有多向分化潛能、支持造血和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。自從2001年發現脂肪來源干細胞以來，由于其具有數量巨大，對患者損傷較小，獲取相對容易，更重要的是脂肪間充質干細胞不易受到腫瘤細胞污染，更容易進行體外凈化，病人可以用自體細胞，并且移植細胞更易被患者自身組織所接受，更快的整合到自身組織系統以發揮作用，克服來自骨髓或者臍帶血所存在諸如難以收集、成本高以及必須通過組織相容性驗證發現合適匹配的缺陷，同時避免了一系列的倫理問題和異體細胞的免疫排斥等移植副反應，所以在臨床應用上有極大的優勢和廣闊的前景。

目前，從脂肪組織提取間充質干細胞一般通過水浴酶消化30～60分鐘，一次性離心收集單個核細胞，并進行貼壁培養去除紅細胞等非貼壁細胞，從而得到較純的間充質干細胞，然而，這種一次性酶消化得到的間充質干細胞的數量和質量往往不能同時保證，消化時間過短不能從組織中完全解離單個干細胞，消化時間過長，最初解離出的單個干細胞受到消化酶的過渡作用，對細胞狀態造成傷害，最終得到的間充質干細胞狀態好壞不均，為了防止消化酶的過度作用以得到良好的勻質細胞就必須通過對大量的脂肪組織(一般需要200ml以上)短時間作用，因此，為了保證從脂肪中成功提取間充質干細胞需要大量的脂肪組織，這就需要通過無菌條件下濕性抽脂法抽取200ml以上脂肪，抽脂過程中需要大面積的局部麻醉，并在抽脂部位切一個口，導致患者抽脂面積較大，手術時間較長，出血較多或導致發熱現象，如果后期護理不好容易引發炎癥對病人造成一定的創傷和痛苦。所以急需改進脂肪間充質干細胞的提取技術，減少脂肪組織的用量，以減少抽脂過程對病人造成的痛苦。

目前，間充質干細胞體外擴增培養體系中一般都含有一定濃度的胎牛血清，使用濃度至少10％才能保證細胞的正常生長傳代。然而，間充質干細胞在高濃度血清培養時，隨著傳代次數增加，細胞增殖能力下降，形態由長梭形變為寬大扁平，逐漸喪失多向分化能力。另外，動物血清可能存在動物攜帶的潛在病毒或支原體污染，對以后可能的臨床應用構成威脅。盡管研究人員嘗試了很多的無血清培養基方案，但間充質干細胞在無血清培養基中普遍存在生長緩慢，多向分化能力逐漸消失的問題，為了提高細胞的增殖速度必須通過添加大量的非血清添加劑，例如CNI02634482A(專利申請號201210010246.8，申請公布日2012.08.15)添加了近十種成分，完全培養基的配置費時費力，且培養狀態容易受單一成分的影響，至今無血清培養基仍未能獲得重大突破。所以，急需開發一種安全、穩定、快速、高質量擴增間充質干細胞的培養體系。

發明內容

本發明提出一種提取及培養間充質干細胞的方法，解決了現有技術必須從200ml以上脂肪組織才能提取干細胞的問題，大大降低了提取成本，同時將病人的創傷降到接近零，二是避免了使用胎牛血清帶來的各種弊端，且解決了現有技術中完全培養基的配置費時費力，且培養狀態容易受單一成分的影響，質量低的問題。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種提取及培養間充質干細胞的方法，包括下列步驟：

1)將150～250ml血液，放在肝素鈉抗凝管中，在2～8℃保存；

2)將上述制得的抗凝血1500～2100r/min離心8～12min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血漿，將所述富含血小板的血漿在2～8℃下保存1～7天備用或在-75～-85℃下長期保存備用；

3)將5～10mL的脂肪組織靜置8～12min后分層，移除下層紅細胞聚集區的液體；

4)用添加有抗生素的磷酸鹽緩沖液30～40ml重懸脂肪組織，1200～1800r/min離心3～7min洗滌上述去除紅細胞后的脂肪組織一次；

5)用質量濃度為0.05～0.15％的I型膠原酶懸浮上述洗滌后的脂肪組織，其中所述膠原酶和所述洗滌后的脂肪組織的體積比為1.5∶1～2.5∶1，混勻后置于37℃水浴中消化，開始計時，并每隔1～3分鐘振蕩該懸液；