[發(fā)明專利]一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310235337.6
• 申請(qǐng)日: 2013-06-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103275998A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李瑋;張金秀;王立安;李天云;陳嬌嬌;鞠建松;薛張偉;張琳琳;張慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北博倫特藥業(yè)有限公司;河北師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12P13/24;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊新世紀(jì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 13100
• 代理人: 張素靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段及其應(yīng)用，屬于基因工程、酶工程、生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)

羥脯氨酸(Hydroxy?proline,?Hyp)?不屬于常見(jiàn)20種氨基酸，是脯氨酸羥基化修飾的結(jié)果，羥基通常加在第4或是第3位碳上。由于有兩個(gè)不對(duì)稱的碳原子，所以羥脯氨酸有4種立體異構(gòu)體。分別為反式-4-羥基-L-脯氨酸，順式-4-羥基-L-脯氨酸，反式-3-羥基-L-脯氨酸和順式-3-羥基-L-脯氨酸。

反式-4-羥基-L-脯氨酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要存在于膠原蛋白中，對(duì)形成穩(wěn)定的三股螺旋膠原蛋白具十分重要的作用，可使結(jié)締組織的彈性和韌性得到加強(qiáng)（Shibasaki,?T.?Mori,?H.?ozaki,?A.?2000）。體液羥脯氨酸平衡失調(diào)會(huì)造成許多疾病，例如營(yíng)養(yǎng)不良，老年癡呆癥，牙齒、骨骼中的軟骨和韌帶組織的韌性減弱以及組織纖維化疾病等（Rajesh?N.?Kalaria,?Andrea?B.?Pax?.?1995）。

近年來(lái)，羥脯氨酸的研究和開(kāi)發(fā)已引起醫(yī)藥、生化、食品及美容業(yè)等方面的廣泛關(guān)注。在醫(yī)藥方面，由于其具有多種生理功能與獨(dú)特的生物活性，可作為各種軟組織疾病的藥物，如結(jié)締組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，又可加快傷口愈合，治療各種皮膚疾病。反式-4-羥基-L-脯氨酸易于衍生化，藥理活性多樣，近年來(lái)逐漸被應(yīng)用到醫(yī)藥原料藥手性中間體領(lǐng)域，用于合成新一代培南類抗生素、抗腫瘤、?抗高血壓及新型胃藥等多種新創(chuàng)制藥物的合成。由于其具有抗氧化、抗輻射的作用，在美容業(yè)方面，可以作為化妝品添加劑。目前，世界用量為500噸/年以上，其需求量仍然呈逐年增加趨勢(shì)。

目前，我國(guó)反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)主要采用化學(xué)水解提取工藝，以動(dòng)物膠原蛋白為原料，通過(guò)強(qiáng)酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過(guò)程制備，?“三廢”排放量大、污染嚴(yán)重，能耗高、純度低及生產(chǎn)成本高。因此，利用節(jié)能、污染少的生物催化法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸勢(shì)在必行。

生物轉(zhuǎn)化法是指利用細(xì)菌或真菌細(xì)胞中的酶將底物分子轉(zhuǎn)化為功能產(chǎn)物的過(guò)程。反式-4-羥基-L-脯氨酸生物轉(zhuǎn)化法是指利用L-脯氨酸為底物，在Fe²⁺、α-酮戊二酸和L-抗壞血酸存在的條件下，利用反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸。反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因（GenBank?ID：D78338.1）長(zhǎng)816核苷酸，編碼272個(gè)氨基酸殘基，GC含量為66.67%，研究發(fā)現(xiàn)，該酶蛋白主要以包涵體形式出現(xiàn)（Christian?Kleina，Wolfgang?Huttela.?2011）。這種酶最早發(fā)現(xiàn)于鏈霉菌屬?P-8648菌株中（Sheehan,J.C.,?H.G.Zachau,?and?Lawson.?1958）。日本協(xié)和發(fā)酵公司經(jīng)過(guò)菌株的大量篩選，從自然界中篩選到一株具有反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶活性的孢囊菌屬菌株，并且利用此菌株反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因，構(gòu)建了L-羥脯氨酸生物合成工程菌，進(jìn)一步提高了L-羥脯氨酸的產(chǎn)量，專利號(hào)為：ZL94115662.1。隨后，日本科學(xué)家利用該菌株中的反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶基因，根據(jù)宿主菌的偏好性和密碼子的兼并性對(duì)該基因進(jìn)行了密碼子的同義突變，構(gòu)建了不同表達(dá)載體進(jìn)行酶的表達(dá)和活性檢測(cè)研究，發(fā)現(xiàn)含有串聯(lián)雙色氨酸啟動(dòng)子的表達(dá)載體酶活性最高，催化L-脯氨酸轉(zhuǎn)化成反式-4-羥基-L-脯氨酸的轉(zhuǎn)化效率可高達(dá)87%。但他們構(gòu)建的表達(dá)載體不是常見(jiàn)載體，構(gòu)建過(guò)程十分的繁瑣，轉(zhuǎn)化過(guò)程是直接將底物加到培養(yǎng)中的大腸桿菌工程菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基成分復(fù)雜，不易于后續(xù)的分離純化，在工業(yè)化利用方面存在一定缺陷性。2010年，德國(guó)科學(xué)家利用pET-28a作為載體，利用GroEL/GroES伴因子來(lái)提高酶的可溶性，轉(zhuǎn)化L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的能力是61%，轉(zhuǎn)化效率不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段，可用于高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸。較全長(zhǎng)酶，該基因片段編碼酶活性高，轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間短，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

本發(fā)明還提供所述基因片段的表達(dá)產(chǎn)物以及含有所述表達(dá)產(chǎn)物的工程菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明還提供了所述基因片段的應(yīng)用。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案：

本發(fā)明提供的編碼高活性反式-4-羥基-L-脯氨酸羥化酶的基因片段核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，其表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。