[發明專利]一種調控集胞藻中不飽和脂肪酸合成的方法及其應用

有效

• 申請號: 202010159165.9
• 申請日: 2020-03-09
• 公開（公告）號: CN111321175B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 陳高;鐘懷榮;曹月蕾;范仲學;崔曉艷;于金慧;李燕樂;路曉媛
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 濟南竹森知識產權代理事務所(普通合伙) 37270
• 代理人: 朱家富

1.敲除spkD基因在降低藍藻中多不飽和脂肪酸合成中的應用，所述spkD基因核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

2.如權利要求1所述應用，其特征在于，所述spkD基因作為調控亞油酸、γ-亞麻酸、α-亞麻酸和十八碳四烯酸表達量的基因。

3.一種降低集胞藻中多不飽和脂肪酸合成的方法I，其特征在于，包括步驟如下：

（1）用引物對spkD-F，spkD-R對集胞藻PCC6803基因組DNA進行PCR擴增，得到spkD基因，所述spkD基因核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

（2）擴增后的spkD片段與pClone007 simple載體連接，然后轉化入大腸桿菌DH5α中進行克隆，得到007-spkD質粒；

（3）將007-spkD質粒使用EcoR I內切酶進行酶切，將spkD基因切開，EcoR I內切酶的酶切位點前的spkD基因片段作為同源重組上游臂，酶切位點后的spkD基因片段作為同源重組下游臂；

（4）用EcoR I內切酶酶切質粒pBluescript-Kan，回收卡那霉素片段，與同樣經EcoR I內切酶酶切的步驟（3）制得的質粒007-spkD連接，制得質粒007-spkD-kan；

（5）將步驟（4）制得的重組載體007-spkD-kan轉化到集胞藻PCC6803，經篩選，制得敲除spkD基因的集胞藻突變株。

4.如權利要求3所述方法I，其特征在于，所述步驟（1）中，spkD基因以集胞藻PCC6803基因組DNA為模板，進行PCR擴增獲得，PCR擴增引物核苷酸序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

5.如權利要求4所述方法I，其特征在于，所述步驟（1）中，PCR擴增體系如下：

2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μL，模板DNA 1μL，引物spkD-F 1μL，引物spkD-R 1μL，ddH₂O 7μL，共計20μL；

PCR擴增程序如下：

95℃預變性3min，94℃變性25s，60℃復性25s，72℃延伸l min，35個循環后，72℃終延伸5min，4℃保存。

6.權利要求3制備的敲除spkD基因的集胞藻突變株用于調控多不飽和脂肪酸的合成。