[發(fā)明專利]一種核酸助沉劑及改良的循環(huán)腫瘤DNA的提取方法

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• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN111500677A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣國平;麻錦程;曾麗;賈俊玲
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江樹人學(xué)院(浙江樹人大學(xué));樹蘭（杭州）醫(yī)院有限公司;浙江默樂生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發(fā)明公開了一種核酸助沉劑及改良的循環(huán)腫瘤DNA的提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的核酸助沉劑，由Carrier RNA、Acryl Carrier、PolyA、糖原中的至少一種與醋酸鈉組合而成。本發(fā)明公開的改良的循環(huán)腫瘤DNA的提取方法，通過在血漿樣本中添加助沉劑，以提高樣本中游離DNA的檢測得率。本發(fā)明在提高樣本中游離DNA提取得率的同時，提高了對腫瘤突變基因的檢出率，有助于臨床對腫瘤診斷的輔助作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種核酸助沉劑及改良的循環(huán)腫瘤DNA的提取方法。

背景技術(shù)

循環(huán)腫瘤基因(ctDNA)，是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA，來源于死亡腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變DNA片段，存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中，為游離DNA。它是一種具備廣泛應(yīng)用前景、高敏感性、高特異性的腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤的診斷、治療及預(yù)后檢測等方面發(fā)揮重要作用，可應(yīng)用于腫瘤的液態(tài)活檢，進(jìn)行腫瘤的早期篩查診斷。而ctDNA的含量非常低，因此ctDNA的高效提取成為腫瘤液態(tài)活檢技術(shù)的關(guān)鍵之一，提高ctDNA的提取率可以提高ctDNA突變的檢出率，從而提高腫瘤早期篩查的準(zhǔn)確率。

核酸分離與純化的方法一般包括細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個主要步驟。核酸的分離和純化是關(guān)鍵步驟，核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性，根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異，用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。不同方法得到的核酸提取效果不一樣。

對于游離DNA(cfDNA)的分離純化方法主要為酚-氯仿法、硅膠膜吸附柱法和磁珠法。傳統(tǒng)的酚-氯仿法提取效率低、重復(fù)性差，且有毒溶劑用量多，操作復(fù)雜，容易發(fā)生污染。硅膠膜吸附柱法是結(jié)合特定的緩沖溶液、精確的pH和鹽濃度實(shí)現(xiàn)對核酸的吸附。該方法快速、核酸純度高、重現(xiàn)性好，其主要缺點(diǎn)是對小片段核酸的提取效率較磁珠法低，且常用離液鹽條件，對后續(xù)的鹽分洗滌比較繁瑣、冗長。柱提法還存在的一個嚴(yán)重的問題是高速離心造成的剪切力，容易降解DNA，影響DNA的完整性。目前市場上主要的硅膠膜吸附柱法提取游離核酸的產(chǎn)品是Qiagen公司的試劑盒，不但價格較昂貴，而且回收率僅約40％。磁珠法核酸純化技術(shù)采用了納米級磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標(biāo)記了一種官能團(tuán)，能同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)。磁珠提取技術(shù)可用于多種樣本的批量處理，是自動化、高通量的最佳選擇之一，且操作簡便，耗時短，但是市售的多數(shù)提取試劑盒對游離DNA的提取率不夠高，不適合腫瘤循環(huán)DNA這樣含量極低的游離DNA的提取，因此不能很好的在腫瘤液體活檢技術(shù)中得到應(yīng)用。

因此，提供一種核酸助沉劑及改良的循環(huán)腫瘤DNA的提取方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種核酸助沉劑及改良的循環(huán)腫瘤DNA的提取方法，對現(xiàn)有磁珠法提取游離DNA的方法進(jìn)行改進(jìn)，通過在樣本中添加核酸助沉劑，以提高游離DNA的提取得率，對腫瘤循環(huán)DNA的提取具有很好的效果，可應(yīng)用于腫瘤液體活檢。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種核酸助沉劑，用于循環(huán)腫瘤DNA提取，由0.5-1.5μg/μlCarrierRNA、l-3μg/μlAcrylCarrier、1-5μg/μlPolyA、2-6μg/μl糖原中的至少一種與0.1-0.6mol/μl醋酸鈉組合而成。

進(jìn)一步，一種核酸助沉劑，由1.0μg/μlCarrierRNA、3μg/μl糖原和0.2mol/μl醋酸鈉組合而成。

進(jìn)一步，一種核酸助沉劑，由1.5μg/μlAcrylCarrier、4.0μg/μlPolyA和0.3mol/μl醋酸鈉組合而成。

進(jìn)一步，一種改良的循環(huán)腫瘤DNA的提取方法，具體步驟如下：

(1)分離血漿樣本；