[其他]用生物轉化生產10-羥基喜樹堿的方法

無效

• 申請號: 85100520
• 申請日: 1985-04-01
• 公開（公告）號: CN85100520A
• 公開（公告）日: 1986-08-13
• 發明（設計）人: 朱關平
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海藥物研究所
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C07D498/22;//
• 代理公司: 中國科學院上海專利事務所
• 代理人: 費開逵

本發明屬于應用微生物方法轉化的技術領域。

于1966年開始，Wall等報導從我國引種的喜樹（Camptotheca????acuminata????Denc）中分離得到抗癌有效成分喜樹堿Camptothecine（Ⅰ），10-羥基喜樹堿10-Hydroxy????Camptothecine（Ⅱ）和10-甲氧基喜樹堿10-Methoxy????Camptothecine（Ⅲ）等。1971年Stork和Schultz等完成了喜樹堿的全合成工作，我國以1969年起，陸續從喜樹中也分離到喜樹堿和10-羥基喜樹堿等有關的化合物，1976年又完成了喜樹堿和10-羥基喜樹堿的全合成。

（Ⅰ）R＝H （Ⅱ）R＝OH （Ⅲ）R＝OCH₃

10-羥基喜樹堿的化學結構與喜樹堿相似，僅在10位上的氫由羥基取代，經動物藥理和臨床試驗證明，在治療腫瘤方面比喜樹堿有較好治療效果和較低的毒付反應。于1977年10-羥基喜樹堿作為腫瘤臨床的一只新藥，在國內通過鑒定，並應用于治療肝癌、胃癌、頭頸部腫瘤和白血病等。

過去10-羥基喜樹堿從喜樹中提取，得率甚低，約為生藥的十萬分之二，提取過程中需用大量有毒的氯仿和甲醇，以及接觸有毒的喜樹堿等本身物質，致使10-羥基喜樹堿的生產發生困難，成本昂貴。制造10-羥基喜樹堿的全合成雖然獲得成功，由于步驟多;總收率較低，也無生產實際意義。

本發明的目的是為了解決10-羥基喜樹堿的生產問題。本發明采用生物轉化的方法，將喜樹中含量較高的喜樹堿（提取得量為萬分之七左右），轉變為10-羥基喜樹堿。作者曾于1978年在科學通報上簡單地報導了利用曲霉T-36菌株，可將喜樹堿轉化為10-羥基喜樹堿。后又經過菌種的誘變，菌體生長和轉化條件的改進。現采用黃曲霉T-419菌株，使轉化率從20%提高到50%以上。特別又研究成功采用了隋性大孔樹脂分離提取10-羥基喜樹堿的新工藝，進一步降低了生產成本和解決了勞動保護問題，使10-羥基喜樹堿具備了實際生產的條件。

利用本發明生產10-羥基喜樹堿比原來從喜樹中提取10-羥基喜樹堿的方法有如下優點。

1.擴大了生產10-羥基喜樹堿的來源，用原來從喜樹中提取的方法，只能得到十萬分之二的10-羥基喜樹堿，而另一產量較高的喜樹堿因臨床毒性較大，而成為無用物質。通過本發明可將這部分喜樹堿轉變為臨床上有較好評價的10-羥基喜樹堿。

2.革除了大量氯仿和甲醇以及上硅膠柱分離的工藝，使操作人員免去接觸大量有毒氣體和喜樹堿類本身的粉末。

3.節約了大量溶劑和試劑，再利用了喜樹堿后致使10-羥基喜樹堿的生產量可大大增加等，使生產成本要比原方法低得多。

一、生物轉化的菌株鑒定

我們共篩選了數百株真菌，其中T-36菌株通過對其轉化產物的理化分析證明，確具有轉化喜樹堿為10-羥基喜樹堿的能力，后又將T-36菌株的孢子經過紫外光處理10分鐘后，所分離得到的變株T-419其形態和培養的基本特征與T-36菌株一致，僅在10-羥基喜樹堿的轉化率上比T-36菌株高6-10%，故以后的工藝試驗皆用黃曲霉菌株T-419，T-419菌株的形態和培養特征：T-419菌株在Czapek′s固體培養基上菌落近園形，很快向四周蔓延，菌落表面帶黃綠色的分生孢子。菌絲無色，無可溶性色素分泌。菌絲有橫膈，為多細胞的菌絲體。分生孢子梗的頂端膨大成半球形的頂囊，在頂囊表面以輻射方式長出一層或雙層小梗，在小梗頂端形成一串分生孢子。這些都是典型的曲霉屬Aspergillus的形態特征，在電子顯微鏡下觀察其孢子表面光滑近球形。由于孢子呈黃綠色，故其種應命名為黃曲霉菌株T-419。

二、轉化產品的鑒別

喜樹堿通過黃曲霉菌株T-419轉化后的培養液，菌絲用乙脂提取，濾液用乙酸乙脂提取，分別濃縮后合并，再甲醇迥流，上硅膠柱層析，用氯仿沖洗，除去喜樹堿成分，然后收集2-4%甲醇的氯仿的沖洗液，濃縮后得到固體粉末，再在氯仿∶甲醇（1∶1）混合溶劑中結晶數次，即能得到純的黃色柱狀結晶的轉化產物。其熔點旋光、質譜、紫外光譜、紅外光譜、核磁共振譜等的理化性質數據都與天然分離得到的10-羥基喜樹堿完全一致（表1）。采用隋性大孔樹脂分離獲得10-羥基喜樹堿經質譜、紅外、紫外、核磁光譜分析也與天然的10-羥基喜樹堿完全一致。

三、200公升罐內的生物轉化工藝實例

1.生物轉化的工藝流程：