[其他]牛焦蟲疫苗制造方法

無效

• 申請號: 85100848
• 申請日: 1985-04-01
• 公開（公告）號: CN85100848B
• 公開（公告）日: 1987-09-02
• 發明（設計）人: 張中行
• 申請（專利權）人: 寧夏農科院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/018
• 分類號: A61K39/018;C12N1/10
• 代理公司: 農牧漁業部專利事務所
• 代理人: 陳如明

本發明涉及生產牛焦蟲疫苗的方法，特別是涉及 以高速轉動培養技術生產牛焦蟲疫苗的方法。

牛焦蟲病是一種寄生蟲病，主要分布在亞洲、非 洲、歐洲三十多個國家，世界上十億頭牛中，約有四分 之一的牛可能受到蜱的叮咬而受到血液原蟲的傳染， 每年因各種泰勒焦蟲病死亡數十萬頭，因此，牛焦蟲 病引?起了有關國家的高度重視。研究牛焦蟲疫苗較 早的國家有以色列、印度、土耳其，但它們都處于試驗 室試驗階段。檢索的蘇聯莫斯科庫茲明克獸醫試驗 研究所在英國申請的專利(專利號2050161A，申請 日1979年6月4日，公布日1981年1月7日)，也處 于實驗室靜止單層培養階段，由于數量質量等原因不 能用于病區防疫。我國在牛焦蟲疫苗的研究方面，已 經投入批量生產，廣泛用于牛焦蟲病的防預。國內開 展這項研究工作較早的是中國農科院蘭州獸醫研究 所，其研究結果，在《中國農業科學》1982年第四期 88-95頁上已發表。本發明人在中國農科院蘭州 獸醫研究所的基礎上進行了中間擴大試驗研究，把靜 止單層培養改為轉動培養，從而使牛環形泰勒焦蟲裂 殖體膠凍細胞疫苗的制造由實驗室小批生產階段轉 入生藥廠大批生產階段。其靜止培養和低轉速培養 (6周/小時)生產過程中都是將懸浮細胞從培養瓶 倒入離心管內離心后，倒掉清液，還要向培養瓶內加 入細胞分散液(即威爾遜液)，振蕩培養瓶使貼壁細胞 全部脫落，再倒入另一離心管離心，去掉威爾遜液，把 兩次離心的沉淀細胞混合以這種方法收獲培養瓶上 的貼壁細胞，不僅要額外消耗許多化學藥品，而且為 了收獲貼壁細胞，還須投入較多人力，花費許多時 間。并且威爾遜液對活細胞有破壞作用，隨著培養時 間增加將導致死亡細胞數增加，影響疫苗的質量。

本發明就是為了解決培養細胞貼壁問題，使其增 殖細胞都懸浮于培養液中，以簡化收獲貼壁細胞的產 生過程，從而達到節省人力、時間、藥品，減少投資，降 低細胞死亡數的目的。

本發明的特征是在無菌的操作下，把種子細胞接 入培養瓶內的培養液中，將培養瓶于37℃溫室下放 置轉管機上轉動培養，培養瓶以每小時50至60轉轉 動，培養120小時，繁殖一代，連傳十五代以上制苗， 其每代增殖細胞完全混合于懸浮液內，大部分結為集 團細胞，少數單細胞分散于懸浮液中。

本發明解決細胞貼壁問題是通過下列方式實現 的：

為了阻止或破壞細胞貼壁現象的發生，首先肯定 了不能用化學方法長時間脫壁，因化學藥品接觸活細 胞時間越長，對細胞破壞性越大，造成細胞死亡數增 加，實驗證明：活細胞在威爾遜液內70分鐘，活細胞 死亡2％，120分鐘，活細胞死亡60％，因此，發明人 采取了物理方式，即用改變培養瓶旋轉速度方式解決 細胞貼壁問題。基于這種設想，考慮到細胞培養瓶自 身旋轉的速度越快，則細胞停留在一個固定位置的時 間越短，則貼附于該處的機會和可能性就越??；當轉 速達到某一速度時有可能出現細胞貼壁功能的受阻 或遭到破壞。因此，作了轉速與細胞貼壁率之間的關 系試驗，實驗結果在表1中給出：

表1??轉動培養牛焦蟲疫苗所用轉速與細胞貼壁 率之間的關系

根據旋轉速度與細胞貼壁率的關系測定結果表 明：細胞培養瓶的旋轉速度達到40周/小時時，細 胞貼壁率降為1％，旋轉速度達到50周/小時，以 及速度超過50周/小時以上，細胞貼壁率皆為 0％固將阻止細胞貼壁現象產生最低轉速定為 50周/小時。

更有意義的是，在我們分析轉動培養的轉速與細 胞脫壁率的關系時，還研究了轉動培養的轉速與細胞 存活率的關系，其測定結果如表2所示

表2轉動培養牛焦蟲疫苗轉速與細胞存活率之 間的關系

根據表2所示結果可以看出，將靜止培養改為轉 動培養，達到60周/小時轉速時并未出現活細胞死 亡現象，但繼續增加轉速時，細胞存活率開始下降，因 此，把轉速60周/小時確定為最適轉速的上限值。 觀察與分析結果表明，轉動培養的細胞在形態構造、 體積、透明性、懸浮生產性能。含裂殖體百分率， pH變化以及疫苗的質量、效力等方面，與靜止培養 沒有差異。