[其他]鄰苯二酚胺類分析法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 85101463
• 申請(qǐng)日: 1985-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1004382B
• 公開(kāi)（公告）日: 1989-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林守正
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 株式會(huì)社島津制作所
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利代理部
• 代理人: 吳大建;羅宏

鄰苯二酚胺類的分析法，其特征是，在含有鄰苯二酚胺類的試樣中或從這個(gè)試樣中萃取出鄰苯二酚胺類的萃取液中，按次序加入第１反應(yīng)試劑鐵氰化鉀緩沖液，第２反應(yīng)試劑抗壞血酸水溶液或含有乙二胺四醋酸抗壞血酸水溶液及第３反應(yīng)試劑氫氧化鈉溶液，使鄰苯二酚胺類變成三羥基吲哚、其反應(yīng)液經(jīng)固相萃取后，使其附在用二氧化硅為抯體的化學(xué)結(jié)合型反相柱子并用酸性緩沖液流動(dòng)相進(jìn)行洗提的高速液相色譜儀上將腎上腺素，去甲腎上腺素分離，然后進(jìn)行熒光分析。

本發(fā)明是使鄰苯二酚胺類轉(zhuǎn)化為三羥基吲哚，然后經(jīng)固相萃取。使其附著在高速液相色譜儀上分離，進(jìn)行熒光分析。本發(fā)明為再現(xiàn)性良好，靈敏度高，價(jià)格低廉的鄰苯二酚胺類分析法。

過(guò)去，血漿、尿等的生物試樣中的鄰苯二酚胺類的分析法，是把鄰苯二酚胺類萃取出來(lái)，再洗提，把洗提液附著在用二氧化硅為擔(dān)體的化學(xué)結(jié)合型逆相柱子并用酸性緩沖液流動(dòng)相進(jìn)行洗提的高速液相色譜儀上分離。隨后使三種反應(yīng)試劑按次序進(jìn)行反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為三羥基吲哚（THI），進(jìn)行熒光分析，即所謂柱后法。

上述方法中，為了把用高速液相色譜儀分離的鄰苯二酚胺類轉(zhuǎn)化為THI，需要用泵輸送3種反應(yīng)試劑。若用ペリスタリツク泵等價(jià)格低的泵時(shí)，發(fā)生脈動(dòng)，噪音水平升高。而用無(wú)脈沖泵，雖然能降低上述脈動(dòng)，但價(jià)格高，兩種情況都不能使噪音水平降低到一定值以下。另一個(gè)問(wèn)題是，由于高速液相色譜儀的洗提液與反應(yīng)試劑混合而稀釋，使分析的靈敏度下降。

本發(fā)明的目的是為了改進(jìn)上述問(wèn)題而提出的再現(xiàn)性良好，靈敏度高而價(jià)格低的鄰苯二酚胺類的分析法。

本發(fā)明提出了鄰苯二酚胺類的分析方法，這個(gè)方法的特征是，往含有鄰苯二酚胺類試樣中或從這個(gè)試樣中萃取出鄰苯二酚胺類的萃取液中，按順序加入第1反應(yīng)試劑鐵氰化鉀緩沖液，第2反應(yīng)試劑抗壞血酸（維生素C）水溶液或含有乙二胺四醋酸的抗壞血酸水溶液及第3反應(yīng)試劑氫氧化鈉溶液，使鄰苯二酚胺轉(zhuǎn)化為三羥基吲哚。其反應(yīng)液經(jīng)固相萃取后，使其附在用二氧化硅為擔(dān)體的化學(xué)結(jié)合型逆相柱子并用酸性緩沖液流動(dòng)相進(jìn)行洗提的高速液相色譜儀上分離，進(jìn)行熒光分析。

本發(fā)明方法的特征是，開(kāi)始就使鄰苯二酚胺轉(zhuǎn)化為THI，然后對(duì)THI進(jìn)行固相萃取，除去其中共存的反應(yīng)試劑及雜質(zhì)，待THI變得穩(wěn)定之后，使其附在高速液相色譜儀柱上分離，然后進(jìn)行熒光分析。柱前進(jìn)行這種三羥基吲哚反應(yīng)的鄰苯二酚胺類的分析法，以前沒(méi)有。

本發(fā)明中，可以在含有鄰苯二酚胺類的試樣中直接加入3種反應(yīng)試劑，使鄰苯二酚胺類轉(zhuǎn)化為THI。也可以用常規(guī)方法（例如，用硼酸凝膠、氧化鋁萃取后，用酸洗提的方法）使鄰苯二酚胺類萃取出來(lái)后，加入反應(yīng)試劑，轉(zhuǎn)化為THI。

如上所述得到的含有THI的反應(yīng)液中，加入檸檬酸水溶液等酸，使pH降低到3～5之后，再使THI進(jìn)行固相萃取。如用Bond Elut C₁₈（ァナリテイケム公司制造）、Sep-pack C₁₈（ウオ-タ-ブ公司制造）等，使THI吸附在反相色譜儀的前處理用二氧化硅的柱子上，再用例如檸檬酸鈉水溶液與甲醇的混合液，乙腈與甲醇的混合液等洗提。

把所得到的洗提液、附在用二氧化硅為擔(dān)體的化學(xué)結(jié)合型反相柱子并用酸性緩沖液的流動(dòng)相進(jìn)行洗提的高速液相色譜儀上分離，然后進(jìn)行熒光分析。柱子使用ゾルバツクスODS（杜邦公司制）、Shim-pack FLC-ODS（島津制作所制）等，流動(dòng)相是用pH為4～5的檸檬酸鈉、醋酸鈉、磷酸鈉等的水溶液。

根據(jù)本發(fā)明的柱前法，如上所述THI附在高速液相色譜儀柱上之前，進(jìn)行固相萃取除去反應(yīng)試劑及雜質(zhì)，因而THI在化學(xué)上變得穩(wěn)定，從而得到再現(xiàn)性良好的分析結(jié)果。再有，本發(fā)明的方法，與過(guò)去所使用的柱后法比較，沒(méi)有因稀釋而引起的熒光分析光譜的峰形寬大的問(wèn)題，分析的靈敏度高。并且不需要各種反應(yīng)試劑輸送用的泵及反應(yīng)管。因此具有價(jià)格低的優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)施例

人血漿試樣1ml按常規(guī)方法用氧化鋁處理，取含有鄰苯二酚胺的萃取液200μl，按下列順序使鄰苯二酚胺轉(zhuǎn)化為THI，進(jìn)行固相萃取。

（1）加入第1反應(yīng)試劑

含有1w/v%鐵氰化鉀的0.1M磷酸鉀緩沖液（pH6.8），加入30μl，放置30秒。