[其他]逆向斑點(diǎn)分子雜交技術(shù)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 85109606
• 申請(qǐng)日: 1985-12-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN85109606A
• 公開(kāi)（公告）日: 1987-06-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳淵卿;顧健人
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海市腫瘤研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12N15/00;G01N33/576
• 代理公司: 上海專(zhuān)利事務(wù)所
• 代理人: 吳淑芬

本發(fā)明涉及一項(xiàng)新的分子雜交技術(shù)，特別是逆向斑點(diǎn)分子雜交技術(shù)，更為具體地是涉及人體乙肝病毒的一種新的檢測(cè)方法。

乙型病毒性肝炎的病原體乙肝病毒（HBV）是一種引起人體肝炎的脫氧核糖核酸（DNA）的病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界已有二億多人受到乙肝病毒的感染，大量流行病學(xué)資料表明，它的感染與人體原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。

HBV的完整病毒為：含有乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的外殼包裹和乙型肝炎核心抗原（HBc????Ag）、病毒基因組-DNA與該病毒的脫氧核糖核酸聚合酶（DNA聚合酶）構(gòu)成的核心，它又稱(chēng)為Dane顆粒。其平均直徑為42毫微米。由于表面抗原（HBs????Ag）基因在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)，因而在乙肝攜帶者血清內(nèi)還可發(fā)現(xiàn)平均直徑為22毫微米的表面抗原顆粒，由于它并不含有該病毒的基因組DNA及其DNA聚合酶，因而這種顆粒無(wú)致病性。在已有技術(shù)中，已發(fā)展了以下幾種檢測(cè)乙型肝炎病毒感染的方法：

1.利用免疫血清學(xué)方法測(cè)定乙型肝炎兩對(duì)半抗原及相應(yīng)的抗體標(biāo)志，包括乙型肝炎表面抗原（HBs????Ag）及其抗體（抗HBs）、e抗原（HBe????Ag）及其抗體（抗HBe）以及乙型肝炎核心抗原的核體（抗HBc）。這是目前臨床應(yīng)用的常規(guī)方法。由于e抗原在一定程度上代表了核心抗原的存在，因而它的存在對(duì)判定乙肝感染性有一定的臨床意義。然而，上述兩對(duì)半標(biāo)志物，包括e抗原本身并不直接涉及乙肝病毒復(fù)制、增殖，因而它們只能是乙型肝炎病毒感染的間接標(biāo)志。

2.HBV DNA斑試測(cè)定，這是近年來(lái)發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)是直接測(cè)定HBV的病毒基因組，因而是一項(xiàng)測(cè)定乙型肝炎感染性的直接標(biāo)志。但這一方法測(cè)定的結(jié)果，尚不能排除血清中可能存在游離的HBV DNA片段，它們可能是降價(jià)的HBV DNA，同時(shí)由于無(wú)病毒的外殼及該病毒的聚合酶，因而無(wú)感染能力。同時(shí)，該方法測(cè)定時(shí)，首先必須經(jīng)遺傳工程方法擴(kuò)增含HBV DNA順序的重組質(zhì)粒，然后，再把它的載體DNA切除，上述純化物的HBV DNA應(yīng)用制品翻譯（Nick-trans Iation）的方法制得^3eP-HBV DNA探針對(duì)血清樣品進(jìn)行斑試測(cè)定，因而方法較繁復(fù)，成本較高。

3.HBV DNA聚合酶的測(cè)定。早在1973年，凱普萊恩（Kaplan）等應(yīng)用氚標(biāo)記-三磷酸脫氧胸苷（³H-TTP）及其他三個(gè)DNA合成的前生物三磷酸脫氧腺苷、三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷和三磷酸脫氧胞苷（dATP、dCTP、dGTP）滲入的方法測(cè)定HBV內(nèi)源的DNA聚合酶，對(duì)于HBV DNA聚合酶的測(cè)定，反應(yīng)了復(fù)制型的病毒的存在，因而為乙型肝炎的檢測(cè)提供了直接標(biāo)志。但該方法僅通過(guò)三氯醋酸（TCA）沉淀法測(cè)定³H-TTP滲入后的DNA產(chǎn)物的放射強(qiáng)度，經(jīng)過(guò)與幾個(gè)同時(shí)測(cè)定的正常血樣³H-滲入后的平均值進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)來(lái)判定其聚合酶的活力。雖然近年來(lái)此方法已有不少改進(jìn)，如采用三氯醋酸的紙層析來(lái)代替三氯醋酸直接沉淀法以減少³H-TTP的污染等，但由于方法頗為復(fù)雜，同時(shí)又無(wú)法排除血清中可能存在的其他病毒如EBV等DNA聚合酶的干擾，因而仍不能成為特異地確定乙型肝炎病毒感染性的理想標(biāo)志。

本發(fā)明的目的在于克服上述各種乙型肝炎病毒感染檢測(cè)方法所存在的缺點(diǎn)，提供一種簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，確定乙肝病毒感染性的直接而可靠的標(biāo)志，這種方法便是我們?cè)趪?guó)際上首創(chuàng)的逆向斑點(diǎn)分子雜交技術(shù)。