[其他]有生物活性的蛋白質與其生產的方法

無效

• 申請號: 86101830
• 申請日: 1986-02-21
• 公開（公告）號: CN86101830A
• 公開（公告）日: 1986-09-03
• 發明（設計）人: 格溫·格拉博斯基·克里瓦
• 申請（專利權）人: 孟山都公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;A61K37/24;//
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 巫肖南

本發明一種在原核生物里表達異源PNA順序（例如真核生物基因）的方法。在其中一個重要的實施例中，本發明指出了在原核生物里生產具有一個N端為丙氨酸多肽以及用本方法能夠生產各種N端為丙氨酰的多肽。也包括能增加牛奶產量大到出人意料程度的一類纈氨酸bGH（牛生長激素）品種。

由真核生物和原核生物表達基因，在基因轉錄至信使RNA（mRNA）以及隨之又把這種mRNA轉譯成蛋白質中都具有相同的基本步驟時，則要應用細胞內的不同組合以控制這些步驟。

此外，在真核生物里，許多成熟的蛋白質首先被轉譯成為前一蛋白質;即含有與引導順序或信號順序融合的成熟蛋白質順序的多肽。真核生物的信使RNA（mRNA）編碼整套前一蛋白質，它們在轉譯后被加工除去引導順序以后才成為這種成熟蛋白質的。真核生物細胞裝備有把這樣前一蛋白質轉變為成熟蛋白質的特異加工機制，原核生物的細胞一般不能識別存在于真核生物的蛋白質里的這種加工處理信號。因此，如果真核生物信使RNA（mRNA）的完整互補DNA（cDNA）轉錄物被用作DNA順序在原核生物里來表達，那就只發現前一蛋白質而無成熟蛋白質。前一蛋白質在體外轉變為成熟蛋白質是有可能的，但不能沒有重要的代價。

在編碼成熟蛋白質的DNA順序在原核生物里用作成熟蛋白質表達的過程中，這一順序將是沒有真核的轉譯作用和通常包含在作引導順序DNA里的轉譯后加工信號。因此，基于效能以及由于原核生物的宿主細胞也許不能識別真核生物的信號，現已證實，要在原核生物系統里表達所克隆的真核基團或其它異源DNA順序。最理想的是應用原核生物控制訊號。

“異源DNA”一詞在此定義為核DNA至少其有一部分序列不是正常地包含在宿主細胞的染色體組內。異源DNA的實例包括，病毒及真核基因，基因此段，等位基因以及合成的DNA順序但不局限這些。“異源蛋白質”或“異源多肽”一詞在此定義為一種蛋白質或多肽，其中至少有一部分氨基酸順序不是正常地將其密碼編在宿主細胞的染色體組里。

原核生物的控制訊號包括一啟動子，它引發轉錄啟始和轉譯控制訊號包括核糖體結合位點，轉譯啟動以及轉譯停止。除了轉譯停止信號外，所有這些訊號都必須位于真核基因或其它待表達DNA的前面。

技術界已采用一些方法在原核生物里去表達異源DNA（即真核基因）。其中一個方法是，把編碼終產物蛋白的DNA片段與受細菌啟動子操縱編碼細菌的全部或一部分蛋白的DNA相連接。這種內生的原核DNA也需要有核糖體結合位點及轉譯啟動訊號。這樣連接的DNA的表達結果產生一種所謂融合蛋白，它由真核多肽與整個細菌蛋白或部分細菌蛋白組成，這種真核生物的蛋白質的分離就可以用位點特異酶的或化學的方法在內源的一一真核生物的蛋白質融合點上裂解而完成，或用原核生物對多肽順序的選擇降解而實現。

在細菌中，與生產真核生物蛋白融合的蛋白質，有關的出版物包括全歐專利申請47.600（1982，3，17出版）它涉及融合蛋白與非融合蛋白包括，牛前一一生長激素或牛生長激素，在其羧基端（C-）上帶有或在氨基端（-N）沒有。原核生物蛋白質部分的。英聯邦專利申請GB2，073，245A（1981，10，14出版）論及bGH與大腸桿菌E，coliβ-乳酰胺酶（β-Lactamase）的融合蛋白質;E.Keshet等人，核酸研究，（Nucleic????Acid????Research）9∶19-30（1981）論及牛生長激素（bGH）與大腸桿菌β-乳酰胺酶的融合蛋白質;全歐專利申請95，361（1983，11，30出版）論及融合蛋白質包括：依次為，在N基端的內源蛋白質，轉譯起動信號氨基酸，腸激酶切割優點以及羧基端（C-）上的外源蛋白質（即生長激素）。然而，這些融合蛋白質的方法都是繁瑣的，其間在純化之后還需要進行體外加工處理，而且達到商品化所需酶的成本過高。

不過，由于融合的產物似乎能保護終產物異源蛋白質免受細胞內的降解，因此已成為在原核生物細胞中表達某些真核基因或其它異源DNA的一種有吸引力的系統。細菌細胞似乎能識別出在其處產生的某些真核蛋白質是外來的，因而，在這些蛋白質合成時或剛合成后就盡快地使之降解。為保護目的而設計的融合蛋白質應用內源多肽順序放在異源蛋白質的氨基端或羧基端。后者方法的例子見于歐州專利申請111，814（1984，6，27出版）其中論及融合蛋白質、包括一種具有一合成的前一端（氨基端）以及在羧基端（C-）上有一大腸桿菌（E，coli）β-半乳糖苷酶（β-galactosida-se）形式的牛生長激素bHG。它的優越性仍然由于象前面討論過那樣需要最后從內生多肽切割異源蛋白而受貶。