[其他]濃縮和分離人尿中的胰蛋白酶抑制劑及胰激肽原酶的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 86104618
• 申請日: 1986-07-02
• 公開（公告）號: CN86104618A
• 公開（公告）日: 1988-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 幸義和;中西晃一郎;平臺一;佐和桂代子
• 申請（專利權(quán)）人: 日本化學研究株式會社
• 主分類號: A61K37/64
• 分類號: A61K37/64;A61K37/56;C12P9/88
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 羅才希,魏金璽

本發(fā)明是關(guān)于以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)人尿胰蛋白酶抑制劑（此后簡寫為“HUTI”）和人尿胰激肽原酶（此后簡寫為“HUKN”）的方法，并通過把尿中所含的HUTI和HUKN同時濃縮來提高產(chǎn)量。

尿胰蛋白酶抑制劑是一種在哺乳動物尿中所含有的酶活性的抑制劑，已知它的特性的變化依賴于提取它時所用動物的品種。〔Carlson，Enzyme，18，176（1974）〕。HUTI是分子量為68000，等電點為pH2-3的一種糖蛋白，特異地抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血纖維蛋白溶酶〔Sumi，et????al.，Journal????of????Physiol·of????Japau，39，53（1977）〕，人彈性蛋白酶〔Johnson????et????al.，Hoppe????Seyler′s????Z.Physiol.Chem.，363，1167（1982）〕等，并可被視為一種消炎藥而應(yīng)用。另一方面，胰激肽原酶是一種蛋白溶解酶，它產(chǎn)生于活的動物體的各部位，通過對血清中激肽原的分解，產(chǎn)生激肽素，而顯示各種不同的活性，例如降血壓和增加血流量的活性。迄今為止，這二種物質(zhì)由除人以外的不同動物中分離出來，并試圖把它們用作藥物。特別是目前已經(jīng)用豬胰和尿作為天然原料生產(chǎn)出胰激肽原酶。然而，對人來說這些是外源蛋白質(zhì)，具有抗原性，當它們用于臨床時，多次使用常發(fā)生過敏反應(yīng)，因此從安全性觀點來看已經(jīng)遇到了問題。與此對比，HUTI和HUKN是人源的蛋白質(zhì)，因此對人體完全不會產(chǎn)生上述的副作用。

作為HUTI的常規(guī)濃縮純化方法，可能被提到過，例如聯(lián)合使用三氯醋酸、硫酸銨和甲醇的沉淀方法〔N.R.Shulman：J.B.C，213，655（1955）〕，采用斑脫土的方法〔T.A.Strup：Scan.J.Clin.Lab.Invest.，11，181（1959）〕和用DEAE一纖維素的方法〔G.J.Proksch：J.Lab????&????Clin.Med.，79，491（1972）〕。關(guān)于常規(guī)濃縮純化HUKN的方法已知的如用硅膠的方法（已公布的日本專利申請第99151號/1980）和采用微孔型離子交換樹脂，象WA-30的方法（已公布日本專利申請第5515號/1975）以及由本發(fā)明者建立的用聚氨基葡糖作為吸附劑所組成的濃縮純化HUKNR的方法（已公布的日本專利申請第6883號/1984）。此外，同時濃縮HUTI和HUKN的方法是Sumi等所知道的用精氨酸-瓊脂糖的方法〔Sumi，等：Medicine????and????Biology（“Igaka????to????Seibutsugaku”），Vol.100（1）（1980）〕。關(guān)于上面所提及的方法，這些方法試圖用于HUTI或HUKN單個純化和制備，但在成本化費和操作方面總不能滿意，而同時濃縮兩種物質(zhì)的方法由于需要昂貴的吸附劑，操作過程太復雜以至在工業(yè)生產(chǎn)中不能實施。

本發(fā)明者根據(jù)這樣的事實，即在尿中所含的作為有活性的組分的HUTI和HUKN是兩性蛋白，想出一個產(chǎn)生氣泡的主意，并使這些組分停留在氣泡上而實現(xiàn)濃縮。該方法已被用來濃縮尿激酶，即一種尿酶（Celander，DR，Langlinais，R.P.and????Guest，M.M;Areh.Biochem.Biophys.，55，286（1955）〕，但從來沒有用作濃縮尿胰激肽原酶和尿胰蛋白酶抑制劑的方法。因此，在不同的PH值下產(chǎn)生連串氣泡來濃縮尿，而濃縮后的尿?qū)UTI和HUKN的回收率作比較研究。

在檢測尿PH時，下列兩個因素需要考慮：

（1）當PH保持在5.0以下時，HUTI降解成低分子量組分;

（2）HUKN在PH4.0以下時，不穩(wěn)定。

鑒于上述原因，一份60升尿分成10升一份，用6N-HCl或6N-NaoH調(diào)PH為5.0到10.0（不管沉淀在何時分出來，隨時被移去），然后分別裝入直徑為14厘米，高為100厘米的柱內(nèi)（在每個柱的下凸緣裝有一個孔徑為5mm的多孔板）;借助于壓縮泵，把空氣引進柱內(nèi)，產(chǎn)生小氣泡，收集溢流出柱子的氣泡，回收濃縮尿約2升，計算HUTI和HUKN的回收率，所得結(jié)果見表1。

表1.產(chǎn)率與PH值的關(guān)系

產(chǎn)率

pH

HUTI????HUKN

5????62%????58%

6????74%????78%

7????85%????88%

8????69%????71%

9????58%????53%

10????40%????38%