[其他]新的脫氧核糖核酸及其用途

無效

• 申請號: 86106291
• 申請日: 1986-08-20
• 公開（公告）號: CN86106291A
• 公開（公告）日: 1987-05-27
• 發明（設計）人: 大泰治
• 申請（專利權）人: 武田藥品工業株式會社
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P21/00;//;C12R185)
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 王巍

這項發明涉及含有從酵母菌得到的啟動子的新的DNA及其在遺傳工程中的應用。

隨著DNA重組技術的廣泛應用，利用無核或真核生物生產有用的多肽現已成為可能。迄今為止，大腸桿菌被用于大規模生產多肽，然而，希望應用真核生物來生產藥理學上特別重要的多肽。酵母菌是一類真核微生物，與哺乳動物細胞有許多相似之處，因此用于哺乳動物蛋白質編碼基因的表達是有利的。而且酵母菌在它們細胞中確不含內毒素，易于培養。酵母菌的培養過去一直在大的工業規模上進行，它的安全性是肯定無疑的。此外，已經進行了許多研究，去闡明它們遺傳的生物學機制。圍繞酵母菌的上述情況，都已導致它們作為宿主生物用于遺傳工程中。

目前已知有幾種酵母菌基因克隆體。然而，對能有效地表達外源基因的酵母菌啟動子還了解甚少。

已知在一株啤酒酵母的裂解物中，存在有兩種酸性磷酸酶和兩種堿性磷酸酶。發現酸性磷酸酶在細胞的表面。其中一種酸性磷酸酶的產生受無機磷酸鹽的抑制，而另一種酸性磷酸酶是通過結構改變產生的。一種堿性磷酸酶是一種阻遏酶，無機磷酸鹽能抑制它的產生，而且有廣泛的底物特異性。另一種堿性磷酸酶是一種特殊的對硝基苯磷酸酶，它的底物僅是對硝基苯磷酸鹽，而且這個酶的產生是通過結構改變的。分離到了缺乏可阻抑的酸性磷酸酶活性的突變體Pho5、Pho4、Pho2和Pho81。PHO5基因是可阻抑的酸性磷酸酶的一種結構基因，而PHO4、PHO2和PHO81基因是產生蛋白質的基因，這種蛋白質能調節可阻抑的酸性磷酸酶結構基因PHO5的表達。進而PHO4和PHO81基因用來調節類似于PHO5可阻抑的堿性磷酸酶結構基因的表達。

已經知道了酵母菌進行基因克隆的各種載體，現在都已可以應用。為了有效地表達天然或內源的基因，以及外來的或外源的基因，必須選擇一種適合于所用宿主菌的有效的酵母菌啟動子。

圖1是含有PHO81基因的DNA片段插入質粒PAC4的限制性內切酶圖譜;

圖2是DNA片段及其根據本發明克隆的PHO81基因和PHO81啟動子衍生物的限制性內切酶圖譜及PHO81突變的互補能力的圖示說明;

圖3是PHO81轉錄產物鑒定的說明;

圖4說明含有PHO81的克隆的DNA片段進行堿基序列分析的策略;

圖5表示PHO81基因啟動子區域的核苷酸序列;

圖6是構建PAC430質粒的圖解;

圖7是為了adr型肝炎B病毒表面抗原基因表達，構建重組DNA的圖解;

圖8是構建lacz表達質粒的圖解;

圖9表明含有PHO81基因的DNA序列。

本發明注意到了PHO81基因的啟動子（下文中稱為PHO81啟動子），PHO81基因是表達酵母菌可阻抑的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶結構基因表達的一種調節基因。本發明者已經克隆了PHO81基因，測定了克隆DNA的限制性內切酶酶切圖譜，并測定了它的啟動子區域的核苷酸順序。結果，發現該啟動子是一種新的DNA，并適于有效地表達外源的和天然的基因。在以前研究的基礎上作出了本發明。

本發明提供了：一種能調節磷酸酶產生的PHO81基因的啟動子活性，并能從啤酒酵母得到的一種DNA;上述類型的一種重組合DNA;一種在PHO81啟動子下游位置上帶有編碼產生可阻抑的磷酸酶的正調節因子結構基因或其它結構基因的DNA;含有調節磷酸酶產生的PHO81基因啟動子活性的DNA，并能從啤酒酵母得到的一種轉化子;含有上述PHO81啟動子和PHO81啟動子下游的結構基因DNA的轉化子;基因產物生產的過程，包括在培養基中培養含有調節磷酸酶產生的PHO81基因啟動子活性的DNA的轉化子步驟，這一DNA可從啤酒酵母得到，并且帶有位于該PHO81啟動子下游的結構基因，因而，轉化子生長伴隨有基因產物的積累而從培養液中可以回收基因產物。具有PHO81基因啟動子活性的上述DNA，最好是用磷酸來調節它的轉錄。有PHO81基因啟動子活性的上述DNA最好是具有圖9中位置Ⅰ和限制性內切酶

SmaⅠ（）酶切位點之間的堿基順序的DNA。

依據本發明，含有PHO81啟動子以及編碼產生可阻抑的磷酸酶的正調節因子結構基因（PHO81結構基因）的DNA，可以從酵母菌細胞中分離并收集到。

任何菌株的啤酒酵母可以用于這一目的。尤為適用的菌株是一株屬于酵母屬的菌株，如啤酒酵母。商業上可以得到的面包酵母菌和啤 酒酵母菌是適用酵母特有的實例。