[其他]回收蛋白質的方法

無效

• 申請號: 86108729
• 申請日: 1986-12-11
• 公開（公告）號: CN86108729A
• 公開（公告）日: 1987-10-21
• 發明（設計）人: 約瑟夫·約翰·帕特羅尼;馬爾科姆·羅伊·布蘭登
• 申請（專利權）人: 邦奇(澳大利亞)有限公司
• 主分類號: C07K3/28
• 分類號: C07K3/28;C12N15/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 王巍

本發明是關于以可溶型回收開始呈不溶型凝聚物存在的蛋白質的方法。

重組DNA技術為合成大量合乎需要的真核生物的（通常是哺乳動物的）蛋白質，例如激素、干擾素和酶等，提供了潛在的、極有價值的手段。雖然已證明控制如細菌這樣的生物體來生產所需的蛋白質相對來說是容易的，但是寄主生物通常並不將蛋白質產物分泌在培養介質中。因此，這些生物（例如細菌）的溶胞作用。繼之分離所需的蛋白質往往是必不可的。

在大腸桿菌中以高水平表達的真核生物蛋白質，除極少的例外，都是以不溶的蛋白凝聚物形式存在于寄主細胞之中（Marston，F.A.O.，Lowe，P.A.，Poel，M.T.，Schoemaker，J.M.，White，S.，和Angal，S.，Bio/Technology.2（9），1984，729）。例如，由大腸桿菌生產的人胰島素，以形態學上特征的包合體存在于該細菌的細胞中（Williams，D.C.，Van????Frank，R.M.，Muth，W.L.和Burnett，J.P.，Science????215，1982，687）。這些包合體可以占據細胞的大部分容積，而且似乎是通過在該細胞中沉淀和凝聚而產生的真核生物蛋白質的定位積聚部位（同上）。

雖然利用機械方法，例如離心法和過濾法可以有效地、高產率地回收這些不溶性凝聚物，但是之后通常在進一步純化之前必須使這些蛋白質可溶化。

按照現有技術，采用了兩種主要方法，但是這兩種方法均涉及伴有蛋白質變性的增溶作用，接著逐步除去這種變性劑，然后才能夠使此蛋白質慢慢復性。在這些方法之中，有一個方法利用在水中的很高濃度（6-9M）的如脲素或鹽酸胍之類化合物的溶液進行增溶和變性（國際專利申請WO83/04418）;另一方法則利用高pH下堿的處理使蛋白質增溶和可逆變性，然后調至較低的非變性pH下使蛋白質復性?？梢詫⒋硕椒ńY合起來，以便改進回收率（GB8407570）。但是，即使采用這種組合方法，回收率仍然只有30%的水平（GB8407570）。

這些方法具有嚴重的缺點。使用脲素或鹽酸胍的方法，利用的試劑可能很貴，難處理而且危險，難以除去，在生態學上是有害的，而且需用量很大。這些試劑溶液必須重復循環或加以處理，造成額外開支。結果，這些缺點影響了其進一步的大規模使用（Emtage，J.S.，Nature，317，1985，185）。況且，鹽酸胍可能對蛋白質的免疫原性有害。

使用例如氫氧化鈉或氫氧化鉀的堿性增溶，是一種較便宜的替代方案，但是幾乎沒有提供任何實際的簡化手續方面的優點;而且在高pH下，堿性水溶液是反應性的，使已溶解的蛋白質分子遭受不可挽救的損壞。在此二方法中，所需蛋白質的復性作用可能均不完全，導致回收率低，而且此二方法既慢又冗長。

因此，本發明的目的是克服或者至少減小現有技術所面臨的一個或數個困難。

首先，提供了一種回收蛋白質的方法，此方法包括提供一個不溶型蛋白質源，至少一種陽離子表面活性劑源，用至少一種陽離子表面活性劑處理所說的不溶性蛋白質，所說的陽離子表面活性劑用量足以實現增溶作用而使所說蛋白質的結構主鏈基本不變。

所說的至少一種陽離子表面活性劑的量最好超過臨界膠束濃度。

本發明可以具體適合于由重組DNA技術改進的微生物和真核生物細胞系合成的生物活性蛋白質的溶解和回收。這種蛋白質凝聚體可以含有由某種寄主細胞的分裂或溶胞作用分離的包合體，所說的寄主細胞可以用含有一個蛋白質基因密碼的載體轉化或轉染的。但是本發明並不局限于此。此外，本發明可適合于對于許多生物體系共同的，天然存在的凝聚蛋白質復合物。

可以按本發明方法回收的蛋白質凝聚體，可選自包合體和細胞質凝聚體。這些包合體可選自生物活性的多肽和肽類，包括生長激素、干擾素、免疫原和淋巴細胞活素。本文中所用的術語“結構主鏈”是指蛋白質的一級結構和二級結構。

所說的至少一種陽離子表面活性劑的存在量，優選從約2.5-50%重量/體積，最好為2.5～20%重量/體積。表面活性劑含量的上限可以根據所選擇的表面活性劑的溶解度極限變化。

我們現已發現，可以通過在有或沒有一種極性溶劑存在的情況下，用一種陽離子表面活性劑在水中處理，或者單獨用極性溶劑處理使所需蛋白質（包括包合物）的凝聚物增溶。此方法迅速（5-60分鐘），而且回收被增溶蛋白質很容易得到而且可以重新循環。所需的只是少量的便宜試劑，它們是容易得到而且可以重新循環例如，增溶劑的主體可以是水。