[其他]肽定序的方法

無效

• 申請號: 87100897
• 申請日: 1987-02-20
• 公開（公告）號: CN87100897A
• 公開（公告）日: 1987-11-11
• 發明（設計）人: 馬克·L·斯托洛維茲
• 申請（專利權）人: 分析化學國際有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊九昌,曹恒興

本發明涉及到一種對肽及蛋白質進行化學定序的方法，其目的是確定組成肽及蛋白質的各個氨基酸的種類及位置。更具體地說，本發明涉及到超過經典的Edman降解系統的一種改進的方法。

天然存在的及近代由合成產生的蛋白質和多肽都是由氨基酸長鏈組成的化合物。在所有的生命體中都發現有蛋白質并在生命體中具有激素、結構基本成份、酶、免疫球蛋白及生命物質的其他組份的功能。關于蛋白質的功能及結構的研究，經常需要確定蛋白質的氨基酸排列順序（一級結構）。為了用化學方法或應用重組體DNA技術來合成蛋白質或部份蛋白質（如生長激素抑制素、胰鳥素、內啡肽等），在嘗試進行合成之前通常必須確定該種蛋白質所含的氨基酸順序。在包括蛋白質（如免疫球蛋白、酶、病毒外殼蛋白及細胞表面蛋白）功能的探索中，在試圖闡明蛋白質作用的機理時，必須確定蛋白質或多肽的一級結構。在重組體DNA方法研究中，必須確定一級結構以闡明為該一級結構編碼的相應的DNA或RNA結構。

在測定蛋白質或多肽中氨基酸的基本順序時，通常是用一種逐步降解法，在該方法中，將單個的氨基酸逐個地從多肽末端除下以便進行鑒定。Edman降解作用是較好的方法，但是也發展了一些其他的方法并可在某些情況下應用。在Edman降解作用中，是使N-末端氨基酸殘基與一種能有選擇性地從蛋白質上除下該氨基酸殘基的試劑來進行反應以從蛋白質的末端除下氨基酸。所除下的氨基酸衍生物可轉變成一種穩定的化合物，用化學方法可將該化合物從反應混合物中分離出來并進行鑒定。

在五十年代由Edman提出的逐步降解蛋白質及肽的方法〔Edman，P.，斯堪的納維亞化學學報，4，283（1950）〕在過去35年中幾乎沒有什么改變，如圖1所示，該三步的反應過程包括在堿性或無水條件下，在一種溶劑中，使含有N氨基酸的一種肽的N-末端氨基酸偶合到異硫氰酸苯酯（PITC）上（圖1A）。用液-液萃取法（通常用重復的步驟）除去過量的試劑（過量500至10，000倍克分子）并在真空中除去溶劑。然后用無水酸使N-末端氨基酸裂解以形成氨基-末端氨基酸的一種苯胺基噻唑啉酮（ATZ）衍生物以及N-1長度的氨基酸的一種游離肽的鹽，此種肽是除去了末端氨基酸的原本的肽。圖1B。在真空中除去裂解的酸并從留在液相中的殘余肽中萃取氨基酸的ATZ衍生物。然后，接著就使這種及不穩定的ATZ氨基酸與酸的水溶液反應而轉變成一種較穩定苯乙內酰硫脲（PTH）氨基酸。圖1C。然后將此縮短了的殘余肽（N-1氨基酸）用PITC處理以引發另一次降解循環。然后用色譜法鑒定所得到的PTH氨基酸。對于肽中的每個末端氨基酸，用重覆上述的步驟處理。

液相手動的EDMAN技術

在發展的早期，Edman降解技術是用手動來進行的。反應室是一支試管或相似的容器，有時使用一種特殊的罩子，使試劑的添加及除去可在一種惰性氣氛中進行。用注射器或移液管來加入試劑而試劑的清除則用真空操作或將其溶解或萃取入一種溶劑中。在偶合的過程中，將蛋白質或肽溶解于一種堿性偶合緩沖液中。這種方法對于大的蛋白質分子是無效的，因為它們相對地不溶于這種堿性介質中。

在偶合之后，在除去偶合緩沖液及不需要的付產物時出現了許多問題。在這種技術中的一個難題是所留下的肽衍生物可能干燥成為一種膠質薄膜，而難以從其中除去反應的付產物。應用冷凍-干燥的一些方法試圖減輕這一難題。另一個非常大的難題是除去非揮發性物質，因為在將這類物質除去時，肽的PITC衍生物也易溶于同一溶劑中，因而要未留下過量的PITC要未就是使樣品損失。有一種方法是將揮發的試劑除去而留下干的PITC-衍生物及不揮發的付產物。然后選擇一種或幾種易于溶解不需要的物質而較難溶解PITC-肽的溶劑來洗滌該剩余物。然而那些需要除去的物質易于被截留在不溶的PITC-肽的基體中。另一方法是將PITC-肽及其他物質溶于一種含有非極性溶劑的偶合緩沖液中并攪拌之，而非極性溶劑與偶合緩沖液是不相混的。這些其他物質在非極性溶劑中的溶解度很大故可用此種溶劑萃取，而留下極性較強的PITC-肽則溶于極性的緩沖液中。溶有可溶解物質的非極性溶劑可形成一個分離層，而此分離層可用移液管將之除去。但是此步驟似乎將某些PITC-肽萃取到非極性溶劑中。要除去萃取溶劑而不同時除去一定數量的PITC-肽和極性溶劑而且也不讓氧氣進到容器中是極難辦到的。