[其他]從重組體宿主產(chǎn)生抑肽酶同系物及其制造方法，表達(dá)載體、重組體宿主和藥物應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 87102412
• 申請(qǐng)日: 1987-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN87102412A
• 公開（公告）日: 1987-10-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 厄恩斯特-奧古斯特·奧爾斯沃爾德;沃納·施羅德;尤金·施納貝爾;沃爾夫?qū)げ紓愃?/a>;格爾德·萊因哈特;邁克爾·科蒂克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 拜爾公司
• 主分類號(hào): C12N15/00
• 分類號(hào): C12N15/00;C12N9/48;C12P21/02
• 代理公司: 中國(guó)專利代理有限公司
• 代理人: 曹恒興,羅宏

本發(fā)明涉及抑肽酶同系物及其用重組體DNA技術(shù)的制造方法。

本文所述化學(xué)合成的DNA分子，其特征為新的多肽或多肽的DNA順序編碼，實(shí)質(zhì)上與抑肽酶或抑肽酶同系物的氨基酸順序及組合物一致，且具有抑肽酶或抑肽酶同系物的生物活性。

眾所周知，抑肽酶是由58種氨基酸組成的肽，具有抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血漿酶和激肽釋放酶的作用。這是一種基本的蛋白酶抑制因子，取自牛的臟器，是一種有價(jià)值的藥物，又名Trasylol（抑肽酶），用來治療各種疾病，如高溶解纖維蛋白原的出血和外傷出血的休克（參閱H.Fritz和G.Wunderer，1983年，《藥物研究》33期，479～494頁）。

業(yè)已證明，抑肽酶的同系物與抑肽酶相比在15位上是其它氨基酸，而不是賴氨酸，它是有飾變作用和療效作用的有效蛋白酶抑制劑（德國(guó)專利DE-OS????3339693號(hào);H.R.溫澤爾等1985年在《肽和蛋白質(zhì)化學(xué)》3卷）。這些抑肽酶同系物對(duì)胰和白細(xì)胞中彈性蛋白酶，以及組織蛋白酶G有強(qiáng)烈的抑制作用。

在急性的、慢性的破壞結(jié)締組織，損害器壁，壞死病變和肺部組織變質(zhì)的炎癥中，胰腺?gòu)椥缘鞍酌福ㄒ认傺祝⒀獫{彈性蛋白酶（關(guān)節(jié)硬化）、白細(xì)胞彈性蛋白酶的過度釋放引起的疾病，可用這種抑肽酶同系物治療由溶酶體酶特別是白細(xì)胞彈性蛋白酶在由免疫處理引起的炎性反應(yīng)中，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起著同樣重要的作用。

雖然可從牛的臟器以及通過牛胰蛋白酶抑制因子（Tschesche，M.，Wenzel，M.，Schmuck，R.，Schnab，E.德國(guó)專利說明書DE????3339693Al從15.05.58起）的半合成轉(zhuǎn)化得到抑肽酶和抑肽酶同系物，但產(chǎn)量較少。

可見，重組體DNA及有關(guān)技術(shù)的應(yīng)用是提供必要的大量高質(zhì)量抑肽酶同系物的有效方法。目的是生產(chǎn)抑肽酶同系物，及生物活性，宿主生物體是用重組體DNA技術(shù)的產(chǎn)品。

在微生物中，異種DNA的表達(dá)方法是熟知的。

已知氨基酸順序的多肽DNA編碼的制備，可用基因組DNA順序、與mRNA互補(bǔ)的cDNA順序或根據(jù)遺傳密碼及制備合成基因的選擇密碼子。

從牛胰腺的胰蛋白酶抑制因子基因中牛基因組克隆的部分DNA順序的克隆已由S.Anderson和I.B.Kingston（1983年，Proc.Natl.Aead.Sci.USA.80卷，6838～6842頁）說明了牛胰腺胰蛋白酶抑制因子（BPT1）基因組克隆的特征。

近來已把BPT1和牛脾抑制因子Ⅱ的大片段牛基因組編碼編成順序，已由Kingston，I.B.和Anderson，S.發(fā)表（1986年，《Biochem.J.》233期，443～450頁）。

本發(fā)明的目的是提供抑肽酶同系物、及其核酸編碼、結(jié)合核酸和其它轉(zhuǎn)化細(xì)胞的載體，以及獲得抑肽酶同系物的方法。

對(duì)于本發(fā)明的目的，最有利條件是以恰當(dāng)設(shè)計(jì)制備合成基因以及可以廣泛應(yīng)用的選擇密碼子。

特別是這種情況，構(gòu)建包括DNA編碼組或由限制酶的獨(dú)特識(shí)別部位限定的DNA組的合成主導(dǎo)基因。這種基因設(shè)計(jì)在DNA編碼組內(nèi)，可使全部DNA順序容易飾變或突變。

由重組體DNA技術(shù)制備抑肽酶同系物，如Val-15-、Ile-15-、Leu-15-、Phe-15-和Ala-15-、Arg-15、Gly-15、Ser-15、Trp-15、Tyr-15、單獨(dú)抑肽酶，或與在52位上由Glu、Leu、Val、Arg或Thr取代的相結(jié)合，業(yè)已發(fā)現(xiàn)與已知的抑肽酶及其同系物是等同的，在52位上有Met，它們的生產(chǎn)方法將一起介紹。取代Met-52，可生產(chǎn)抑肽酶和抑肽酶同系物，其中在融合多肽的Met位上，用溴化氰把遺傳工程的融合多肽切斷。

還介紹了這種同系物的合成DNA編碼，包括表達(dá)該同系物結(jié)構(gòu)基因的重組體質(zhì)粒，以及由重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌（E.coli）。

下文說明編碼抑肽酶和抑肽酶同系物的DNA片段的構(gòu)建和選擇方案。

已知蛋白質(zhì)順序及抑肽酶和抑肽酶同系物的遺傳密碼用來確定這種多肽的DNA順序的編碼。

遺傳密碼的簡(jiǎn)并性允許在任何給定的氨基酸順序的密碼子選擇中有很大的靈活性。

測(cè)定標(biāo)示這種蛋白質(zhì)的氨基酸順序的密碼子中所有可能的堿基取代。與此相應(yīng)可測(cè)定定位在合理的DNA順序內(nèi)全部潛在限制性部位。

通過下述依據(jù)指導(dǎo)主導(dǎo)基因的密碼子選擇：首先，選擇密碼子和片段，設(shè)計(jì)片段組合，以避免不合適的片段互補(bǔ)性。

其次，富集A-T堿基對(duì)的范圍，避免用早期轉(zhuǎn)錄的末端解決問題。