[其他]用清蛋白聚合的血清親合結(jié)合法純化乙型肝炎表面抗原前-S-區(qū)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 87102799
• 申請日: 1987-04-17
• 公開（公告）號: CN87102799A
• 公開（公告）日: 1988-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: E·戴爾·萊曼;特德·F·謝弗;威廉·J·麥卡里爾
• 申請（專利權(quán)）人: 默克公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N7/02;A61K39/29
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣,辛敏忠

本發(fā)明涉及純化酵母表達(dá)的重組體前-S-Hepatitis????B表面抗原（HBsAg，前S-肝炎B）的一種快速有效方法。

已證實該表面抗原肝炎B前-S區(qū)是病毒受體位點，在肝炎B病毒進(jìn)入肝細(xì)胞之前，該區(qū)結(jié)合于肝細(xì)胞，Valenzuela????et????al，Bio/Technology????3∶317-320（1985），該前-S區(qū)結(jié)合于聚合的血清清蛋白，認(rèn)為聚合的血清清蛋白與肝細(xì)胞膜有關(guān)，因此，含有前-S的，衍生的重組體抗原被稱作可誘導(dǎo)抗體的一類抗原，這些抗體能阻斷肝炎B病毒與感受性宿主細(xì)胞的接觸。肝炎B病毒含有前-S的表面抗原已從感染的人類血漿中分離得到，Neurath????and????Strick，Arch.Virol????60：79-81（1979），最近并用Valenznela，supra描述的標(biāo)準(zhǔn)重組體技術(shù)得到。事實上，Neurath和Strick能采用與人類聚合的血清清蛋白選擇性結(jié)合的方法從HBeAg陽性人類血清中分離小量HBsAg。該HBsAg可用3M硫氰酸鈉從連接了聚合的人類血清清蛋白的瓊脂糖柱上洗脫。以此方法得到了25倍到80倍純化血清HBsAg。然而，這一程序不能純化重組體衍生的前-S（2）HBsAg。

重組體前-S-HBsAg用快速有效兩步層析方法純化。破裂表達(dá)重組體前-S-HBsAg的酵母細(xì)胞，澄清該細(xì)胞內(nèi)含物并用聚合的人類血清清蛋白親合層析法分離。該前-S-HBsAg可用丁基瓊脂糖疏水作用親合層析進(jìn)一步純化。這種方法得到高于90%純度的前-S-HBsAg。

因此，本發(fā)明目的之一是提供一有效方法以純化重組體衍生前-S-HBsAg。另一目的是提供一種方法，其允許快速，高純度高產(chǎn)率重獲前-S-HBsAg。本發(fā)明的這些目的和其它目的可從下文敘述中看出。

本發(fā)明涉及一快速兩步方法從酵母細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中分離前-S抗原，在這種酵母細(xì)胞中該肽段是用重組體技術(shù)產(chǎn)生的。當(dāng)下列敘述和實例描述與前-S（2）-HBsAg相關(guān)的本發(fā)明時，應(yīng)明了本發(fā)明適用于任何含有與肝炎B表面抗原-S區(qū)相關(guān)的肽段的蛋白質(zhì)。實例包括重組體衍生的前-S（1）S（2）-HBsAg，及未與肝炎B病毒表面抗原S區(qū)共價結(jié)合的前-S（1）S（2）和前-S（2）多肽。

表達(dá)前-S（2）HBsAg的重組體酵母用Valenzuela????et????al。敘述的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)得到，Bio/Technology，3：317-320（1985），表達(dá)前-S（2）-HBsAg的酵母細(xì)胞用Carty????et????al方法生長，Eighty-Fourth????ASM????Meeting????p.194，1984，收集這些細(xì)胞，離心并重懸于含約0.1M磷酸鈉，約PH7.2，0.5MNacl的高滲緩沖液，濃度約50%（Wt/wt），貯于-70℃。細(xì)胞在約20-23℃時融解，離心并重懸于Breaking緩沖液，其中含約0.1M????HEPES，PH7.5，補(bǔ)充有0.01M????EDTA，1μg/ml抑胃肽，0.13單位/ml????aprotinin0.01M苯胺-鹽酸及2mM苯基-甲烷，磺酸（PMSF）。該混合物1-7次通過Stansted壓機(jī)以破裂細(xì)胞。破裂細(xì)胞漿液通過離心8，000xg????45分鐘4℃而澄清。

澄清的酵母提取物加入-含有偶聯(lián)了聚合的人類血清清蛋白（PHSA）的Sepharose4B柱。人類血清清蛋白是按Machi-da????et????al，Gastroent????85：268-274（1983）敘述的方法用戊二醛聚合的，按廠家要求偶聯(lián)于CNBr-激活的Sepharose????4B。用一合適洗脫液洗，用含50mMHEPES????PH7.5和0.5N????Nacl的緩沖液A洗，然后將酵母提取液上柱。合適洗脫液包括堿金屬的一，二或三鹵代醋酸鹽。堿金屬指鋰鈉，鉀，其中鈉最為常用。鹵素指氟，氯，溴和碘，其中氯最常用。因此，最常用為三氯醋酸鈉。當(dāng)所有樣品進(jìn)入柱子，不被吸收的蛋白質(zhì)就用緩沖液A從柱中洗掉。吸收的前-S（2）-HBsAg用三氯醋酸鈉水溶液從PHSA????Sepharose柱中洗掉，三氯醋酸鈉濃度1M-3.5M，最好用3M，PH6-8，最好用PH7。PHSA親合分離得到80倍富集的前-S（2）-HBsAg。聚丙烯酰胺凝膠蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移和銀染證明所分離的組分為前-S（2）-HBsAg，純度至少為50%。