[其他]改進的融合產物

無效

• 申請號: 87104365
• 申請日: 1987-06-23
• 公開（公告）號: CN87104365A
• 公開（公告）日: 1988-02-03
• 發明（設計）人: 賽·P·三卡拉
• 申請（專利權）人: 默里爾多藥物公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 辛敏忠

由Kohler和Milstein在1975年所進行的小鼠骨髓瘤細胞與已被免疫的小鼠脾細胞的融合（Nature.256（1975），495-497），首次證實了連續獲得產生同型（所謂的“單克隆的”）細胞系的可能性以及由這些雜交瘤制造的抗體在各種科學研究和醫學珍斷上的應用。制備雜交瘤的方法一般包括下列步驟：

（a）用一種致免疫劑免疫小鼠或大鼠一類動物。所用的免疫方案應該能夠產生有用量的適當的已接觸抗原的脾細胞。

（b）從被免疫的動物體中取出脾臟，在一種合適的介質中制成脾臟懸浮液。

（c）在一種合適的融合促進劑存在的條件下，將該懸浮的脾細胞與從一合適的細胞系得來的骨髓瘤細胞進行融合。融合促進劑可以是仙臺病毒或是一化學融合劑，如平均分子量約1000至4000的聚乙二醇（（PEG）（如商業上可得到的PEG1000等）。另一項有效的融合技術是根據已知方法的電-融合，如Zimmermann和Scheurich（Planta，151（1981），26-32）、Vienken等（Planta，151（1983），331）以及Jacob等（Sbud.Biophys，94（1983），99）等所使用的方法。所用的骨髓瘤細胞系最好是所謂的“抗藥”型，以便使未融合的骨髓瘤細胞在選擇性培養基上不能存活，而雜種則能存活，最普通的一類是8-氮鳥嘌呤抗性細胞系，由于它缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，從而不能夠在HAT（次黃嘌呤、氨基嘌呤和胸苷）培養基中存活。

（d）在各個容器中用選擇培養基稀釋并培養未融合的脾細胞，未融合的骨髓細胞和融合細胞的混合物，這種培養基將不能維持未融合的骨髓細胞以長時間而使未融合細胞死亡（約一周）。稀釋可以是一種有限型，其中稀釋劑的體積是通過統計學方法計算出來的，以便分離一定量的細胞數（如微量滴定板的每一孔）。在選擇性培養基中，未融合的骨髓瘤細胞死掉。由于未融合的脾細胞是非惡性的，它們僅有有限的代數，因此，經過一段時間后（約一周），這些未融合的脾細胞將不能繁殖。而另一方面，融合細胞由于具有骨髓瘤親本的惡性性質以及脾細胞親本的在選擇培養基上的存活能力，所以能夠連續繁殖。

（e）鑒定在含有雜交瘤的每一容器（孔）中的上清液中抗體的存在，這種抗體是直接抗最初所使用的抗原的。

（f）篩選（如通過有限稀釋）和克隆產生所需抗體的雜交瘤。

一旦所需的雜交瘤被篩選和克隆，則最終的抗體可以通過兩種方式之一產生。最純的單克隆抗體是在試管中在一種合適的培養基上對所需的雜交瘤進行適當時間的培養而產生的。然后由上清液中回收所需要的抗體。該適宜的培養基和適當的培養周期為已知的或很易確定。這一試管技術生產的基本是單一的單克隆抗體，基本上無其它特定的抗人免疫球蛋白。既然培養基中含有異種血清（如牛胎兒血清），所以該抗體中有少量的其它免疫球蛋白存在。但是，這一試管方法不能夠產生用于某些目的的大量抗體或抗體濃縮物，因為單克隆抗體的濃度僅約50微克/毫升。

為了產生在量的純度稍底的單克隆抗體濃縮物，可以將所需的雜交瘤注射進小鼠中，最好是同源或半同源小鼠。適當培養一段時間后，雜交瘤將引起產生抗體的腫瘤的形成，導致宿主小鼠的血流和腹膜浸出液（腹水）中所需抗體的濃度增高（約為5～20毫克/毫升）。

這一方法在文獻中已充分公開，它有特別的和嚴重的缺點。PEG作為融合劑已被越來越多的人所接受，因為其純品易于得到且在所需的分子量范圍內，并且與仙臺病毒比較起來它較容易操縱。但是，PEG有效的整個濃度范圍非常窄。最佳濃度是50±5%（重量/體積）。在這一濃度下，它表現出對將被融合和已經融合了的所有細胞的細胞毒效應。另一方面，當使用亞最佳濃度的PEG時，僅現定到適度的細胞毒性，但是融合效率以及其后的雜交瘤形成都很低。與仙臺病毒相比，已知的化學融合劑如PEG和電-融合不影響被融合的細胞的凝集，因此，細胞膜在緊密貼近處對融合并非直接有效。

因此，本發明的目的之一就是提供能夠產生有用產物的新型融合雜交細胞。本發明的目的之二是發展一種制備雜交細胞的方法，它是將能夠產生有用產物的哺乳動物細胞或植物細胞（如胰島細胞）與能夠連續繁殖的合適的融合配偶體進行融合。本發明的目的之三是要減少常規的化學融合劑的細胞毒作用，這些融合劑包括PEG、溶血卵磷脂、葡聚糖、DMSO（二甲基亞砜）、聚乙烯醇、聚-L-鳥氨酸以及已知有用的鹽如硝酸鈉或其組合物。在融合方法中，這將導致產生高產量的所需的雜環交細胞。本發明的目的之四是產生將被電-融合技術融合的凝聚細胞。