[其他]含谷胱甘肽S-轉移酶基因的除莠劑耐性植物

無效

• 申請號: 87104489
• 申請日: 1987-05-19
• 公開（公告）號: CN87104489A
• 公開（公告）日: 1988-05-04
• 發明（設計）人: 喬吉亞·海爾默爾;約翰·都興斯蒂;文·羅斯特恩;利里阿那·斯卡拉菲亞;瑪麗戴爾·奇爾頓;薇陳·讓·萊;陳培·戴維·屠
• 申請（專利權）人: 希巴-蓋吉股份公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N5/00;C12P21/02;A01H1/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 李瑛

本發明涉及用以轉化植物的DNA重組技術的用途，其辦法是對除莠劑進行解毒以將除莠劑耐性授予植物。更具體地說，本發明涉及DNA重組分子的構建及其用途，此DNA分子包括谷胱甘肽S轉移酶（GST）基因，它在植物中表達后增加植物中GST的酶活性。

GST（EC2.5.1.18）是一類在非生物合成有機物解毒中所涉及的酶。這些酶普遍存在于大多數活的生物體中，這些生物體包括微生物、植物、昆蟲和動物。這類酶中每種GST酶的性質是不同的，然而這類酶又的確呈現某種重迭的底物專一性，參見I.Arias和W.Jakoby（Raven????Press，New????York，1976）所編《谷胱甘肽：代謝及功能》中，Jakoby等人“鼠谷胱甘肽S-轉移酶：結合及其物理性質;Reddy等人“不同個體羊肝GST的純化和性質”，Archives????of????Biochem.and????Biophys.，224：87-101，1983。

在GST的這些功能中，人們特別感興趣的是GST在谷胱甘肽與親電子化合物的結合中所起的催化作用（Phytochemistry，21：2771-2781，1982，H.Rennenberg“高等植物中谷胱甘肽的代謝及其可能的生物學作用”;Meister和Tate“谷胱甘肽及其相應的ρ-谷氨酰化合物：生物合成和利用”，Ann.Rev.Biochem.，45：560-604，1976）。很多非生物合成有機物（包括除莠劑、殺蟲劑和殺菌劑）都是親電子化合物。在谷胱甘肽與化合物的親電中心的連接中，谷胱甘肽的巰基與化合物的親電中心反應。谷胱甘肽是作為一種親核試劑與親電化合物連接而起作用的。該連接是靠專一的GST酶催化的（Rennenberg，同上）。

對植物而言，此反應非常重要，因為它提供了非生物合成有機物的解毒機理。這種親電子的非生物合成有機物的結合作用使它具有水溶性并因此對于植物是無毒的。

因此，最好是利用遺傳工程技術增加谷胱甘肽S-轉移酶在所說植物中的活性水平來培育一類除莠劑耐性植物。采用此法，即可能將除莠劑耐性授予植物。

本發明涉及DNA重組分子，它通過生產使除莠劑解毒的蛋白質將除莠劑耐性授予植物。已知的解毒作用的機理包括：GST催化的谷胱甘肽與親電子化合物的結合、D-氨基酸與2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的結合、磺酰脲的羥基化及其與碳水化合物的結合。更具體地說，本發明涉及用DNA重組分子轉化的一類除莠劑耐性植物，該DNA分子編碼的酶能使除莠劑解毒。確切地講，本發明還涉及所說的DNA重組分子，它包括編碼谷胱甘肽S-轉移酶多肽的基因順序，還涉及谷胱甘肽S-轉移酶活性水平增加的、耐除莠劑的轉移基因的植物細胞。本發明中，所說植物細胞是用谷胱甘肽S-轉移酶基因轉化的，它在表達或超表達后使植物具有除莠劑耐性。

本發明還涉及由此轉化的植物細胞和其種子再生的植株，及其由此轉移基因的植物細胞再生的植物的后代，包括突變體及變種的后代。

本發明還涉及嵌合基因構建體，該構建體含有谷胱甘肽S-轉移酶基因、克隆載體和宿主，以及將除莠劑耐性授予植物的方法。

附圖簡介：

圖1示出了測定Yb200的pGTR200cDNA插段順序的戰略，它是鼠肝谷胱甘肽S-轉移酶基因。

圖2所示為質粒pCIB710（一種大腸桿菌復制子），它包括CaMV35SDNA的轉錄啟動子、終止子及外加的多聚腺苷酸信號。

圖3所示為質粒pCIB12（一種大腸桿菌復制子）的構建，它所含的嵌合基因包括CaMV35S啟動子（它與鼠谷胱甘肽S-轉移酶cDNA基因相連接）、Yb200及CaMV終止子。

圖4A為質粒pCIB14（一種廣宿主復制子）的構建，它在T-DNA邊界中含有兩個嵌合基因，嵌合基因中含有CaMV35S啟動子，它與鼠肝谷胱甘肽S-轉移酶基因、Yb200、CaMV終止子及卡那霉素抗性基因、nos-neo-nos等相連接。

圖4B所示為部分克隆通過活體重組方法的結合。

圖4C為部分克隆通過體外連接法的結合。

圖5所示為無轉移基因的煙草葉片的典型的熒光誘導模型。所示上部曲線為葉片已吸收10^-5M莠去津48小時后的情形，下部曲線為僅用緩沖液抑制后的情形。

圖6所示為pCIB14轉移基因的煙草葉片吸收10^-5M莠去津48小時后熒光誘導的模型。該圖表明了三類反應：（Ⅰ）對莠去津無解毒作用，頂部曲線;（Ⅱ）對莠去津的解毒作用明顯，最下面的曲線;（Ⅲ）有一定程度的解毒作用，中間的曲線。