[其他]人溶菌酶的生產(chǎn)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 87104540
• 申請日: 1987-06-30
• 公開（公告）號: CN87104540A
• 公開（公告）日: 1988-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 菊池正和;吉村浩二;中濱一雄
• 申請（專利權(quán)）人: 武田藥品工業(yè)株式會社
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N9/50
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊九昌,羅宏

本發(fā)明涉及生產(chǎn)人溶菌酶的DNA重組技術(shù)。更具體地說，本發(fā)明涉及人溶菌酶基因的表達(dá)、重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化細(xì)胞及其產(chǎn)物。

溶菌酶是一種較小的酶蛋白，分子量約為14，000。溶菌酶分布于活體組織中，人們認(rèn)為它是作為防御物質(zhì)而起作用的，它通過溶解各種細(xì)菌而抵抗細(xì)菌感染。溶菌酶的功能可能是通過β-葡糖苷酶活性來溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖。雞蛋清中含有大量溶菌酶，因此從其中能夠比較容易地分離到高純度的溶菌酶。這樣的溶菌酶可為了防腐目的加到干酪、香腸和海產(chǎn)品中，或用于將牛奶轉(zhuǎn)化成人的哺乳奶（Katsuya????Hayashi和Taiji????Imofo，《溶菌酶》，Nankodo，Japan，1974）。而且，溶菌酶作為醫(yī)療藥劑可用于止血、消炎、組織再生和抗腫瘤等（參見“Saikin-no-Shinyaku”（日本新藥）Vol.34.107，Yakuji????Nippo，Tokyo，Japan，1983），并且，它已經(jīng)作為消炎酶藥劑上市了。

將來自雞蛋清的溶菌酶用于醫(yī)療目的時(shí)，通常導(dǎo)致過敏癥狀如疹子和發(fā)紅等。這些現(xiàn)象一般稱為對外源蛋白免疫應(yīng)答的副作用。為了克服上述弊病，本發(fā)明者開始了研究以建立一種大量生產(chǎn)人溶菌酶的方法。

人溶菌酶的氨基酸序列是已知的，它由130個(gè)氨基酸組成（“Biochemical????Data????Book”，1：189，1979，日本生化學(xué)會主編）。以此氨基酸序列為基礎(chǔ)，化學(xué)合成了編碼人溶菌酶的DNA片段（Ikehara，M.等人，Chem.Pharm.Bull.，34：2202，1986）。

為了利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)人溶菌酶，Muraki等人試圖在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，但用這種表達(dá)系統(tǒng)沒能得到活性人溶菌酶（Muraki，M等人，Agric.Biol.Chem.，50：713，1986）。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過酵母的分泌作用得到了一種活性人溶菌酶（Jigami等人，《1986年日本農(nóng)業(yè)化學(xué)學(xué)會概要》，P.343，1986）。但其產(chǎn)量非常低，只有600微克/升。根據(jù)Jigami等人的報(bào)道，在人溶菌酶的表達(dá)中，與編碼人溶菌酶的DNA片段相結(jié)合，使用了一種編碼信號肽的CDNA片段，此信號肽具有將所需蛋白分泌到細(xì)胞外的信息。作為編碼信號肽的CDNA片段，使用的是編碼雞蛋清溶菌酶信號肽的CDNA片段（天然型）（此信號肽的序列與Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5759-5763，1980中公開的相同）。然而，進(jìn)行了這樣的結(jié)合后，如上所述，從酵母細(xì)胞中分泌到胞外的溶菌酶數(shù)量仍然很少。

本發(fā)明者利用DNA重組技術(shù)對于活性人溶菌酶的大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)行了詳盡的研究，研究結(jié)果是完成了本發(fā)明。

雖然，人溶菌酶基因目前還未被克隆，但已經(jīng)確定了溶菌酶的氨基酸序列。因此，以此氨基酸序列為基礎(chǔ)，Ikehara等人已經(jīng)化學(xué)合成了編碼人溶菌酶的DNA（Ikehara，M.等人，同上）。

因此，有可能利用此化學(xué)合成的DNA通過DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)人溶菌酶。

作為與編碼人溶菌酶的DNA片段一起使用的編碼信號肽的DNA片段，可以提及的有編碼下述結(jié)構(gòu)式的信號肽的DNA片段：

M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G

考慮到要在酵母中進(jìn)行表達(dá)，因此，最好是利用酵母中高頻率使用的密碼制備編碼蛋清溶菌酶信號肽的DNA片段。使用這樣的DNA片段，發(fā)現(xiàn)能以增加的水平達(dá)到大量獲取人溶菌酶的預(yù)定目標(biāo)。密碼子使用率已有過報(bào)道（J.Biol.Chem.，257：3026-3031，1982）。優(yōu)選的酵母密碼子的實(shí)例在下面以RNA密碼子的形式給出。

氨基酸????密碼子????氨基酸????密碼子????氨基酸????密碼子

Ala????GCU，GCC????His????CAC????Tyr????UAC

Ser????UCU，UCC????Glu????GAA????Cys????UGU

Thr????ACU，ACC????Gly????GGU????Asn????AAC

Val????GUU，GUC????Gln????CAA????Pro????CCA

Ile????AUU，AUC????Lys????AAG????Met????AUG

Asp????GAC????Leu????UUG????Trp????UGG

Phe????UUC????Arg????AGA

圖1給出了通過寡聚核苷酸的集中和連接合成人溶菌酶基因的方法的示意圖;