[其他]肽的制造方法

無效

• 申請號: 87105412
• 申請日: 1987-06-30
• 公開（公告）號: CN87105412A
• 公開（公告）日: 1988-02-24
• 發明（設計）人: 安東尼·約翰·克拉克;理查德·萊恩
• 申請（專利權）人: 藥物用蛋白質有限公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P21/02
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊九昌

本發明是關于制造一種含多肽物質的方法，特別是關于制造蛋白質的方法，以及用酶類蛋白質催化制備生物物質的方法。

在過去的十年里，復合DNA技術越來越多地用于制造工業上重要的生物物質。為此，對用多種醫學上重要的人體蛋白質編碼的DNA順序已進行了無性繁殖，它包括胰島素、血纖維蛋白溶酶原活化劑、α₁-抗胰蛋白酶、以及凝固因子Ⅷ和Ⅸ。目前，雖然出現了復合DNA技術，然而這些蛋白質通常從血液和細胞組織中提純，該方法成本昂貴且費時，并且可能會引起傳染介質的傳播，這些傳染介質會引起艾滋病和肝炎。

盡管在細菌中表達DNA順序，對于產生所需的醫學上重要的蛋白質來說是一個吸引人的計劃，然而事實上細菌作為宿主通常是不能令人滿意的，因為在細菌細胞中，外來蛋白質不穩定而且沒有合格處理過。

認識到這個問題，人們對在哺乳動物細胞組織培養物中的無性系基因的表達方式作了嘗試，而且在某種情況下已經證明這是一個可行的策略，然而動物細胞的間歇發酵是昂貴的、但卻是技術上需要的過程。

因此，需要一種產率高、成本低的制造生物物質，例如經恰當修飾的真核生物多肽的方法，這種方法的一個優點是對人體沒有傳染介質。

根據本發明的第一方面，提供一種制造含多肽物質的方法，該方法包括通過在成年雌性哺乳動物乳腺中表達DNA順序，將用多肽編碼的DNA順序摻入到用乳劑乳清蛋白質編碼的哺乳動物基因中。該物質一般在轉譯后修飾之前或者最好是在之后從成年雌性哺乳動物的乳劑中回收。

在本說明書中使用的術語“多肽”是指包含氨基酸鏈的分子，無論鏈的長度對于劃為蛋白質是否合適，多肽最好具有足夠長的分子而成為蛋白質。“含多肽物質”可以是多肽本身，或者是改性的（例如糖基化的）多肽，或者此外也可以是在多肽經轉譯后修飾之后，交叉連接的物質。

本發明可用于生產肽激素、血液凝固因子（特別是因子Ⅷ和Ⅸ）或它們的亞基（特別是因子Ⅷ和Ⅸ）、血液蛋白質（例如β-珠蛋白）和血清蛋白（例如α₁-抗胰蛋白酶）、糧食蛋白、包括天然或改進的宿主哺乳動物的乳蛋白、或酶。

本發明產生的酶能在原位作用于乳腺底物，因此，可以看出本發明包括一種生產酶反應產物的方法，該方法是通過在成年的雌性哺乳動物乳腺中表達DNA順序，將用酶編碼的DNA順序摻入用乳劑乳清蛋白編碼的哺乳動物基因中，然后由一種或多種酶作用物來催化制備反應產物，該反應產物一般從成年的雌性哺乳動物乳劑中回收。

最好在試管中，將用肽編碼的DNA順序（“所需的DNA順序”）摻入到乳劑乳清蛋白質基因中形成融合基因，這種蛋白基因可以在成年的雌性哺乳動物中表達。通過向已受精的哺乳動物卵注射融合基因，從而將融合基因插入種系中，此后，注射過的受精卵發育為成年的雌性哺乳動物。人們預計并非所有注射過的卵都能發育成所需的DNA順序表達的成年雌性哺乳動物。此外，將近一半的動物是雄性，在下一代生育雌性動物。

而關于外來DNA順序可以插入到哺乳動物種系中的有關技術已用于小鼠。目前，最有效的途徑需要將幾百個直鏈DNA分子直接顯微注射到受精卵細胞的原核中，這是本發明的優選方法。顯微注射過的卵然后轉移到假孕養母的輸卵管中，進行培養。Brinster????et????al在Proc????Natl????Acad????Sci????82（1985）4438-4442中報道培養的小鼠大約有25%繼承了一個或多個顯微注射的DNA拷貝。從商業觀點出發，顯然在本發明中，最好將具有高乳劑產率的哺乳動物作為宿主哺乳動物。因此，優先選用家畜，例如綿羊、豬和羊，下面將進一步詳細討論。

研究大量家畜需要相當大的投資，尤其是在所需動物的數目及其成本方面。每個超數排卵的小鼠產生30個卵是正常的，而母羊排卵數只有3至5個。所遇到的另一個問題是農場動物的卵還不透明，這是由于它存在大量的囊，這就使得鑒別及向其原核進行成功注射更為困難。然而，向兔子、綿羊和豬的卵中注射DNA已由Hammer????et????al在Nature????315（1985）680-683中作了報道，他將金屬硫固生長激素融合基因注入這三種動物種系中。這2035個豬卵進行注射并轉移，有192只小豬出生，其中20只帶有融合基因。該結果對綿羊卻并不如此令人鼓舞，對1032個羊卵進行注射并轉移，但只有73只羊出生，其中只有一只羊含有外來DNA順序。