[其他]2-氨基-4-甲膦酰丁酸抗性基因及其應用

無效

• 申請號: 87105764
• 申請日: 1987-08-22
• 公開（公告）號: CN87105764A
• 公開（公告）日: 1988-11-30
• 發明（設計）人: 埃克哈德·斯特羅克;沃夫岡·霍勒本;沃特·阿諾德;里納特·阿利亞;阿里德·普勒;格哈德·沃納;魯迪格·馬奎特;蘇三尼·格拉布利;迪特·布羅爾;克勞斯·巴徹
• 申請（專利權）人: 赫徹斯特股份公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N5/00;A01H1/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 李瑛,顧柏棣

Phosphinothricin（PTC，2-氨基-4-甲膦酰丁酸）是谷氨酰胺合成酶的抑制劑。PTC是抗生素2-氨基-4-甲膦酰-丙氨酰-丙氨酸的“結構單位”。此三肽（PTT）具有抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌以及抗真菌灰葡萄孢（Botrytis????cinerea）的活性（Bayer等人，Helv.Chim.Acta????55∶224，1972）。PTT是由綠色產色鏈霉菌（Streptomyces????viridochromogenes）Tu????494菌株（DSM40736，DSM4112）產生的。

德國專利2，717，440號公開了PTC可起全除莠劑（total????herbicide）的作用。已公開的PCT申請WO86/02097號描述了植物對PTC的抗性是歸因于谷氨酰胺合成酶的過量生成。這種類型的過量生成（如從基因擴增所導致的）易遭受不穩定的風險。因此，這樣一種不穩定性將帶來谷氨酰胺合成酶過量生成的下降，將致使重新出現PTC的競爭性抑制作用。

與之相反，在權利要求中所限定的本發明涉及一種PTC抗性基因及其在生產PTC抗性植物中的應用。此外，該基因還可作為抗性標記使用。而且，該基因可適于L型外消旋PTC的選擇性N-乙酰化作用。

本發明的PTC抗性基因能由下述步驟得到：用BamHⅠ酶切以PTT抗性選擇出來的綠色產色鏈霉菌DSM4112菌株的總DNA，克隆大小為4.0Kb的片段，然后選擇PTT抗性。限制性圖譜（圖1）詳細描繪了該4.0Kb片段的特征。

對該4Kb片段部分進行克隆實驗，以更精確地確定編碼區的位置。此實驗結果表明，抗性基因位于1.6Kb的SstⅡ-SstⅠ片段上（圖1中位置0.55至2.15）。用BglⅡ消化產生0.8Kb大小的片段，此片段摻入質粒中并轉化變鉛青鏈霉菌（S.lividans）后賦予PTT抗性。此抗性是由PTC的N-乙酰化產生的。

對此0.8Kb片段進行Maxam和Gilbert序列分析得到DAN序列Ⅰ（見附頁）。抗性基因的位置可從這一序列的開放讀碼（open????reading????frame）確定（從位置258起）。此基因讀碼終點位于圖示的倒數第二個核苷酸（位置806），即最后一個核苷酸（位置807）是終止密碼子的第一個核苷酸。

用下加線條強調標明了DNA序列Ⅰ中的Shine-Dalgarno序列，作為起始密碼子的GTG也用線條標出。而且，頂部線條標出了確定的讀碼。

DNA序列Ⅱ顯示已確定了序列的基因中的限制性切點。沒有標出切斷此序列六次以上的酶。

抗生素PTT由細菌攝取并被降解為PTC。后者也抑制細菌中的谷氨酰胺合成酶，致使細菌因缺乏谷氨酰胺而死亡。因此，產生PTT的細菌應當具有保護自身不受PTT影響的機理，也就是說，防止再度攝取已生產的PTT，或者對已降解的產物PTC進行修飾。但令人吃驚的是，PTT生產菌綠色產色鏈霉菌DSM4112對其自身的抗生素敏感。但出人意料地證實，通過選擇PTT抗性，有可能以10^-5的極高頻率發現抗PTT的選擇體，而且，此選擇體還能抑制相鄰菌落的本底生長。

通過分離此DNA、用BamHⅠ切斷并連接到鏈霉菌載體中建立了這些選擇體DNA的基因庫。將連接混合物轉化到市售的變鉛青鏈霉菌TK23菌株中，每1μg連接混合物產生大約5000至10000個含有大約1至5Kb插入段的轉化體。在這些轉化體中有PTT抗性變鉛青鏈霉菌株。有可能通過質粒分離并重新轉化到變鉛青鏈霉菌中，證明該抗性是由質粒編碼的。負責此抗性的基因位于4Kb????BamHⅠ片段上（圖1）。編碼區位于0.8Kb????BglⅡ片段上。BamHⅠ片段中不含下列酶的切點：ClaⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、HpaⅠ、KpnⅠ、PvuⅠ、PvuⅡ和XhoⅠ。

將抗性基因的限制性圖譜（還沒有詳細確定其特征）與吸水鏈霉菌（S.hygroscopicus）FERM????BP-130/ATCC21705（歐洲專利申請，公開號0，173，327，圖7）相比較表明，本發明的抗性基因不同于已知基因，其為尋找PTT生物合成基因過程中發現的。

一方面使綠色產色鏈霉菌DSM4112和變鉛青鏈霉菌TK23的細胞提取物與PTC和乙酰輔酶A保溫，另一方面使PTT抗性的綠色產色鏈霉菌選擇體和攜有質粒的變鉛青鏈霉菌轉化體與PTC和乙酰輔酶A保溫，有可能表明后面的細胞將具有乙酰化活性。層析分析表明乙酰化發生在氨基上。