[其他]制備乙型肝炎復合疫苗的方法

無效

• 申請號: 87106697
• 申請日: 1987-08-13
• 公開（公告）號: CN87106697A
• 公開（公告）日: 1988-10-05
• 發明（設計）人: 伊格爾·維克托羅維克·克拉希尼科夫;尼科拉·尼科拉維克·格拉諾夫斯基;維克托爾·米克哈洛維奇·茨丹諾夫;里姆·維克托羅維奇·彼特羅夫;伯里斯·米克哈洛維奇·吉爾多;伊里納·朱里夫納·科特科瓦
• 申請（專利權）人: 免疫所;蘇聯醫學科學院伊萬諾夫斯基病毒所
• 主分類號: A61K39/29
• 分類號: A61K39/29
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 李瑛

本發明涉及生物工藝學領域，更準確地說，涉及制備乙型肝炎復合疫苗的方法，該種疫苗在以人類的疫苗預防接種為目的的醫學中得到了應用。

目前，為了與乙型肝炎的廣泛傳染作斗爭，唯一有效的手段就是疫苗。

已知有各種各樣的制備乙型肝炎疫苗的方法，其中包括在培養基中培育酵母菌株-HBsAg抗原激活體，接著將酵母細胞破壞，分離并純化抗原。例如，歐洲專利EP.BO135435敘述了制備乙型肝炎疫苗的方法，該方法是以釀酒酵母（Saccharomyces????Cerevisiae）細胞ATCC????20665的變體H52來培養HBsAg表面抗原，需時四天。首先將細胞置于長頸瓶中，在28℃下培養8小時。然后把細胞培養物放入裝有培養基YEHD的發酵器中。發酵過程在28℃及攪拌的情況下進行14-40小時（PH5.0）。經過40小時后把培養物加入到100升的培養基YEHD中，于發酵器中在攪拌情況下培養48小時（PH5.0），在過程中，溶解氧的濃度為飽和度的20%。

用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞群體并將其在2-8℃下保存3天，然后往其中加入1%的PMSF，使其中的PMSF最終濃度達到2mM。接著在均化器中將細胞破壞。所獲HBsAg抗原的濃度為0.9毫克/升，蛋白質總含量為1.523克/升。然后使HBsAg抗原通過二氧化硅滲濾，用磷酸鹽緩沖液洗滌并在56℃下于5mM的硼酸鹽緩沖液（PH9.1）中培育20分鐘，所說的緩沖液含有0.25%（重量）的脫氧膽烷。然后，在一個含有對HBsAg為抗體的柱中以親合色譜進行純化，以3M硫代氰酸氨溶液（PH7.2）洗提。然后進行滲析，以除去磷酸鹽緩沖液。往這含水物中加入氫氧化鋁，以使其PH達6.7，在室溫下攪拌、離心分離、并用生理溶液（0.85%的NaCl溶液）稀釋。還有其它的制備疫苗的方法是：把按上述方法制得的細胞提取液和二氧化硅混合在一起，在37～39℃下培育2.5小時。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌該混合物，再用含0.25%（重量）脫氧膽烷的0.05M硼酸鹽緩沖液（PH8.9～9.2）來洗提HBsAg抗原。將所獲抗原離心分離。將上層清液加入到一個事先用5mM NaCl、6.25mM Tris、及0.5mM MgCl₂的混合溶液處理過的紙漿柱上。過程在溫度為4℃及PH為7.5的條件下進行。然后用同一種緩沖液洗滌該柱子并以含0.2M NaCl的緩沖液洗提。未吸附的部份，在總蛋白質為13毫克內含7.95毫克的純HBsAg抗原。然后把所獲物質加進瓊脂糖凝膠6B柱上并用磷酸鹽緩沖溶液洗提，洗提速度為60毫升/小時。在瓊脂糖凝膠6B柱上，在PH7.2的條件下對抗原進行16小時的滲析純化，以除去磷酸鹽緩沖液中的3M硫代氰酸氨，然后獲得了純凈的抗原。再用強化的滲析方法來把硫代氰酸氨從磷酸鹽緩沖液中分離掉，把純化過的產品用磷酸鹽緩沖液稀釋并吸附于氫氧化鋁上，接著進行與上述方法相同的步驟。

所述的方法包括了使用親合色譜，這個過程導致HBsAg抗原活性的降低。此外，在洗提抗原時可能導致部份抗體從親合的吸附劑上解吸下來，這一點，在制備用于人類的疫苗的情況下是很不理想的（異類抗體的存在可提高制品的反應活性）。此外，在所說的方法中使用了PMSF及硫代氰酸氨等有毒物質，這一點在要把所獲疫苗用于人類的情況下是不能容許的。

還有一種已知的制備并純化乙型肝炎疫苗的方法，該方法適用于大規模地生產乙型肝炎疫苗（歐洲專利EP.BO155007）。該方法包括：培養釀酒酵母菌株-HBsAg抗原激活體，接著進行HBsAg的吸附，所用的吸附方法包括把細胞破壞和在10℃下及在添加磷酸鹽緩沖液的情況下將其與二氧化硅混合。接著用0.05M Na₂CO₃或NaHCO₃（PH＝10.5）與尿素的混合溶液在37℃下將HBsAg洗提。往上層清液中加入10%的醋酸使溶液達到PH7.2，并在超濾器中將其濃集。在磷酸鹽緩沖液中，通過瓊脂糖凝膠G1-6B進行膠體過濾并用同一個緩沖液洗提。接著在羥磷灰石上進行抗原的純化。用添加有0.5M磷酸鉀緩沖液的0.05M KCl溶液進行洗提。所獲最終產品的產率為46%（重量）。雖然如此，以上述方法來制備純HBsAg抗原，其產率是不夠高的。在最終階段使用了磷酸鉀緩沖液，由于它的毒性，這種方法在制備用于人類的疫苗的情況下是很不理想的。