[其他]體內細胞示蹤

無效

• 申請號: 87107218
• 申請日: 1987-10-30
• 公開（公告）號: CN87107218A
• 公開（公告）日: 1988-06-08
• 發明（設計）人: 保羅·卡爾·霍蘭;休·埃倫·斯萊扎克
• 申請（專利權）人: 史密絲克萊恩貝克曼公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;A61K49/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊厚昌

本發明涉及體內示蹤細胞的方法及測定體內細胞壽命的方法。

體內細胞示蹤及壽命測定需要用一個在細胞內穩定的標志來標記細胞，即，該標志不會從細胞中丟失也不顯著地影響細胞功能。現有可用的標志不能提供這些必需的特性。例如，熒光抗體因其容易從細胞上解離而不適用。其它可能的標志因其干擾細胞功能而不能使用。

花青染料已用于各種生物學用途。二氧羰花青染料已用來進行白細胞分類計數。Gunter????Valet，Max????Planck????Ges????Wissensch;專利登記號84-102307/17，《通過選擇性染色及測量體積和熒光同時定量測定血細胞》。但在這些研究中用的染料是短鏈羰花青染料（少于10個碳）并對膜電位的變化起反應。而且，短鏈羰花青染料進入細胞的線粒體，是有細胞毒性的，并且當洗滌細胞時，不論細胞膜電位是否改變，這些染料都容易滲漏出細胞。在許多其它生物學試驗中用其它短脂肪鏈花青染料。但短鏈分子會對膜電位起反應并穿過細胞膜，進入線粒體。H.M.Shapiro，美國專利號4，343，782，1982年8月10日。短鏈染料也對細胞有毒性而不能用于體內示蹤細胞。

三羰花青染料（Fox，I.J.，et????al.，proc.Mayo????Clinic，32：478-484，1957）和伊文思藍（Evans-Blue）染料（SChad，H.，et????al.，Pfluegers????Arch.Eur.J.Physiol.，370（2）：139-144，1977）已通過釋釋法用于體內測定心輸出量。Dow（Dow，P.，Physiol.Rev.，36：77-102，1956）將此方法描述為，在肺的靜脈側注射已知量的某種血管內指示劑，測定該指示劑的動脈濃度的時間過程，以確定在注射和取樣兩點間的容量。這些染料不用來染色細胞。

本發明是體內示蹤細胞和測定體內細胞壽命的新方法。根據本發明的細胞示蹤新方法，首先將細胞用花青類染料標記，然后將其注射給受試者，花青類染料用來確定細胞的位置。在另一個實施方案中，通過測量標記細胞消失的速率來確定細胞壽命。

在本發明的體內示蹤細胞及測定體內細胞壽命的方法中，用花青類染料標記細胞。在此，具有下列結構的化合物稱為花青類染料：

其中：

y是氧、硫、亞甲基或烷基取代的亞甲基;

m是0-3;

n是12-22。

此處所用的烷基取代的亞甲基系指以任何組合的甲基、乙基或丙基取代的單或雙取代的亞甲基。

上述結構的化合物可用下列通用的速記式來表示：

DiYC_n（2m+1）

Sims，P.J.，et????al.，Biochem，13：3315（1974）。這樣，如該化合物中Y是硫，有三個碳連接兩個環，并有兩個十四碳的脂肪鏈，則表示為DiSC₁₄（3）。類似地，DiIC₁₄（5）表示該化合物中Y是異丙基，有五個碳連接兩個環，并有兩個十四碳的脂肪鏈。

包括在此處稱為花青類染料的化合物，是具有一個或多個取代的上述結構的化合物，假定這樣的取代化合物至少在標記所需的時間內溶于細胞標記介質，并且有足夠高的膜分配系數以保持與標記的細胞膜相連。這樣的化合物還必須在標記所需的濃度下不顯著影響細胞的活性。如下所述測定染料在細胞標記介質中的溶解度：通過將花青類染料分散在標記介質中，用常規熒光分光光度技術測量熒光強度隨時間的變化。熒光強度減弱表明染料沉淀并附著于容器壁上。例如，可用已知的流式細胞儀方法監測標記后注入供體動物的紅血細胞的熒光強度，測定染料是否保持同細胞膜相連，注射后基本恒定的標記細胞的熒光強度，可證實染料在細胞膜中的穩定性。

摻入一個可用磁共振成象技術檢測的原子的上述結構的化合物，也包括在此處稱為花青類染料的化合物中。這樣的化合物可用已知技術制備，例如，把氟原子摻入脂肪鏈的一個甲基中。用一伽馬放射體如¹²⁵I標記的上述結構的化合物在此也歸入花青類染料。

本發明中所用的花青類染料可從各種來源如Molecular????Probe，Inc.，Eugene，Oregon買到，也可用已知的合成方法從現有的起始物質制備。Hamer，F.M.，《花青染料和有關化合物》，Interscience????Publishers（1964）。