[其他]應(yīng)用由重組體DNA技術(shù)制備的125—I—dsDNA測定在生物液體中的抗-DNA抗體效價的方法和用于此測定的分析儀器

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 88100541
• 申請日: 1988-01-30
• 公開（公告）號: CN88100541A
• 公開（公告）日: 1988-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 川村雅英
• 申請（專利權(quán)）人: 日本DPC有限公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;G01N33/53;G01N33/535;G01N31/16
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊九昌

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）病人的血清中含有可與細(xì)胞核的多種組份（包括核酸核蛋白以及雙鏈DNA（dsDNA）和單鏈DNA（ssDNA）的多種結(jié)合）反應(yīng)的自身抗體。有些可與個別的堿基或核苷酸，與鳥嘌呤和缺少胸腺嘧啶脫氧核苷的序列反應(yīng)，甚至與合成的聚核苷酸（1，2）反應(yīng)。而且，這些自身抗體還可與脂類抗原復(fù)合物〔如心脂和其他的血小板膜磷脂，抗-聚（ADP-核糖）、組蛋白〕反應(yīng)以及和蛋白多糖，即透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素反應(yīng)。但是，抗體與dsDNA或天然的DNA（nDNA）的反應(yīng)是這種疾病的血清學(xué)上的主要標(biāo)志，而且已經(jīng)證明在診斷和監(jiān)測疾病活動性時其測定dsDNA的能力是特別有幫助的。

已經(jīng)設(shè)計出許多分析方法以檢查和半定量在SLE病人體內(nèi)的dsDNA。用于鑒定這些自身抗體的方法已包括凝膠擴(kuò)散法（3）、補(bǔ)體結(jié)合法（4）、被動皮膚過敏反應(yīng)法（5）、皂土凝集作用法（6）、血紅細(xì)胞凝集作用法（7）、放射電泳法（8）、應(yīng)用³H或¹²⁵I的放射分析法（9）和酶免疫分析法（10）。

大多數(shù)（如果不是全部的話）上述的方法缺乏特異性和靈敏性。在大多數(shù)情況下，由于缺乏SEL與其他結(jié)締組織疾病的鑒別診斷的特異性，而得到假陽性結(jié)果的報告。

雖然在應(yīng)用放射分析和酶免疫分析來測定SLE在有關(guān)病情程度和嚴(yán)重性方面已表明是合格的。但是，所有這些方法都是應(yīng)用得自小牛胸腺的nDNA的標(biāo)記制劑，而這種DNA是由不同長度的高分子量的DNA片段〔平均約含有2萬堿基對（20kbp）〕聚合而成的，因此這些制劑也含有不同數(shù)量的ssDNA。

雖然在這些制劑中ssDNA污染物與補(bǔ)體Clq結(jié)合，但這些20kbp的DNA分子常常非特異地結(jié)合到循環(huán)的血漿蛋白質(zhì)上。因此，這些通常用于測定dsDNA（nDNA）抗體的免疫學(xué)方法，常常要求在DNA示蹤化合物與循環(huán)的抗-DNA抗體進(jìn)行免疫學(xué)的反應(yīng)之前，先將血清或血漿樣品在56℃預(yù)處理30分鐘以鈍化補(bǔ)體Clq。

在理想的情況下最好是一個循環(huán)的抗-DNA????IgG分子僅與一個或兩個給定長度而沒有污染物（特別是ssDNA）的標(biāo)記dsDNA分子相結(jié)合。

為此目的，已設(shè)計了在體內(nèi)將¹²⁵I-脫氧胞苷引入海拉細(xì)胞株內(nèi)而制備標(biāo)記的dsDNA（特別是用¹²⁵I-標(biāo)記的）的技術(shù)。但是，由于在這類制劑中通常有ssDNA污染物作為副產(chǎn)品存在，所以這些在體內(nèi)標(biāo)記的方法不能產(chǎn)生高純度的標(biāo)記dsDNA。

本發(fā)明的目的為在免疫學(xué)方法中特別是用¹²⁵I-標(biāo)記的dsDNA的放射分析中防止上述的缺陷發(fā)生。但是其他的標(biāo)記dsDNA分析也屬于本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明的目的在于設(shè)計一種具有一定長度的適當(dāng)?shù)南薅▔A基對的dsDNA分子，而這種制劑是不含有ssDNA的。當(dāng)應(yīng)用一個產(chǎn)生探測劑（125-碘（¹²⁵I）的信號、酶標(biāo)記物、螢光標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光標(biāo)記物）標(biāo)記時，這種制劑會有一個適當(dāng)限定的特異活性，而且是穩(wěn)定的，并且會特異地結(jié)合到在SLE血清或血漿中的循環(huán)抗-DNA抗體上。

為了達(dá)到這一目的，必須構(gòu)建一個質(zhì)粒DNA并且是從不含ssDNA的大腸桿菌制備的。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶將質(zhì)粒切割而產(chǎn)生長度不超過1.5kbp的dsDNA，并用作示蹤物物質(zhì)。在本發(fā)明中現(xiàn)在所用的質(zhì)粒是由大腸桿菌制備的，但是也可以應(yīng)用生物體例如用枯草桿菌、putida假單胞菌和釀酒酵母所含有的任何其他適合的質(zhì)粒。其他含于生物體的質(zhì)粒對本領(lǐng)域中有經(jīng)驗的人來說都是明了的。此外，化學(xué)合成的dsDNA也可以用來完成本發(fā)明的目的。

現(xiàn)在應(yīng)用下面的實例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明：

實例1

質(zhì)粒DNA、pNDPC1的制備。

圖1 表示用于本發(fā)明實例中的質(zhì)粒DNA、pNDPC1的限制性內(nèi)切酶圖。質(zhì)粒pNDPC1的構(gòu)建如下：用Cfr Ⅰ部份地消化pUC 18（Yanisch-Perron，C.等人，Gene 33：103（1985）），然后用在圖1中所示的T4-DNA連接酶使其自身連接。選擇性的標(biāo)記物的AP^r和Lac^-。

用標(biāo)準(zhǔn)的實驗方法將帶有2431堿基對的pNDPC????1????插入大腸桿菌K12????Jm109中并在一種LB培養(yǎng)基（1%胰蛋白，0.5%酵母萃取液，0.5%NaCl）中培養(yǎng)桿菌。然后用通常的方法純化質(zhì)粒。