[其他]生物液體中白蛋白的測定方法

無效

• 申請號: 88102435
• 申請日: 1988-04-22
• 公開（公告）號: CN88102435A
• 公開（公告）日: 1988-11-09
• 發明（設計）人: 霍華德·格雷;西阿朗·曼根;讓·布羅楚特;伊巴爾·西迪基
• 申請（專利權）人: 電核物理有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 羅才希

本發明是關于定量測定血清中白蛋白的方法，該方法即使在球蛋白和其他血清蛋白存在下也可以進行測定。

測定血液和生物液體（例如尿）中白蛋白的技術在醫藥、診斷和臨床化學上是重要的。一般，血清中蛋白質總量是由所謂“雙縮脲/銅反應”來確定的。該反應涉及Cu²⁺和蛋白質的肽鍵之間形成的帶色配合物（紫色）。分別測定白蛋白和球蛋白時，用鹽析法（例如用堿或硫酸銨）將球蛋白沉淀，并離心分離，然后也以雙縮脲反應單獨測定上清液中的白蛋白。由于這種操作費時，現在已將方法改進為在有其他蛋白質存在下直接測定血清中的白蛋白。例如Delaney于1964年（Proc.Australian Assoc.Clin.Biochem.64（1964），1）介紹了溴甲酚緣（BCG）染料結合的方法定量測定血清白蛋白。血清用緩沖的BCG（pH7.0）稀釋，并于波長615nm測定其吸光度減小，吸光度是隨著白蛋白濃度（高達50mg/ml）而呈線性變化，而且其他用電泳分離的蛋白質如血紅蛋白和膽紅素都不干擾。

然而最好能找到更具體的操作，即是說要找出更不易受到血清中其他分子干擾的方法。總結在權利要求1的方法（即一種定量測定生物液體（即使有球蛋白存在于其中）中血清白蛋白的方法，其特征在于：（1）血清樣品與過量的鹵代-芳族試劑反應，其中至少有一個鹵原子被蛋白質取代，并且該反應導致蛋白質/試劑配合物的形成;（2）測定該反應速率;（3）用其他同位數據計算測得的速率數據，該同位數據是以白蛋白校準量在同樣反應中完成，通過計算提供上述測定結果）是達到這個目的重要步驟。這是完全意想不到的發現，通過這種途徑可以定量確定白蛋白，甚至有大量的球蛋白存在下也可以確定。實際上，本發明能應用的那一類試劑，例如鄰、對二硝基鹵苯，已知是能用蛋白質的NH₂一端基進行雙分子親核取代（見Sager Biochem.J.39（1945），507，1945），其速率次序為F＞Cl~Br.這是意想不到的，至少當鹵素是氟時顯示白蛋白實際上是在血清中能產生明顯反應速率的唯一蛋白質類型，該反應速率即使在其他蛋白質，例如球蛋白存在下也能產生。

另一個意想不到的發現是不必須用記錄形成配合物的光學或其他性質的變化來測定反應速率，而可測定氟釋放量從而方便地得知反應速率。這是意想不到的，因為雖然上述反應（見以下反應式）包括如下氟取代作用（X代表氟），但并未明顯表明一定能找到可直接測定的方式（例如用離子選擇性的氟化物電極測定）。反應式如下：

一種比較好的試劑是能少量溶于水的二硝基氟苯（DNFB）化合物。所以，為了取得最好結果，可用與血清樣品相容的適宜的經緩沖的水介質來乳化DNFB有機溶液。例如，DNFB在苯中的溶液并由緩沖物質所乳化（特點是pH5.5～7.7的0.1～1N溶液），而要分析的血清樣品與乳狀液一起攪拌。析出的氟化物再用任何慣用型的氟離子選擇性電極測定。校準曲線是通過一組白蛋白標準溶液而獲得，并將未知濃度的樣品與校準曲線對比進行測定。存在于血清中正常濃度范圍的球蛋白和其他血蛋白以及游離氨基酸和尿素都不產生干擾。

有機試劑DNFB、醚、甲苯、DMF（二甲基甲酰胺）、DMSO（二甲基亞砜）、THF（四氫呋喃）、EtOH（乙醇）和MeOH（甲醇）也適宜，但較少用，因為它們之中有些能起親核作用而使電極漂移。

緩沖物質的選擇也很重要，已發現，例如慣用的乙酸鹽、三羥甲基氨基甲烷和二甲胂酸鹽緩沖液，其pH值在上述pH值范圍內，結果產生電極漂移，而用磷酸鹽緩沖液（pH5.8～7.6）則看不出電極漂移。雖然這些差別的原因還沒有進行研究，但初步可以假設有機緩沖物質起親核的作用使一些鹵原子取代。雖然本方法可以用可使電極產生漂移的有機緩沖液進行操作（即連續步驟的時間受到控制，使測定結果有重現性），也可以用無機緩沖液，例如磷酸鹽是最佳緩沖物質。

下面可取代的步驟已經被成功地用來代替用緩沖水溶液乳化DNFB試劑來提供反應介質。

用DNFB溶液浸漬一張濾紙并讓其干燥。

進行分析時，把浸漬過的干燥濾紙置于燒杯底部，加入工作緩沖溶液和少量氟化物，用電磁攪拌器攪拌，電極浸入溶液，在穩定一段時間后加入血清樣品，并測量其反應速率。

通常由已知的白蛋白溶液獲得該反應速率存儲于微處理器的存儲裝置里（該裝置與慣用測量電極的儀器相連接），測定未知樣品含量時，將速率記錄，并用存儲的數據進行計算，自動提供樣品中白蛋白濃度的結果。該結果可以顯示在有刻度的記錄紙或顯示在肉眼可以看到的熒光屏上。

下面以實例詳細說明本發明。