[其他]活性態蛋白質之生產

無效

• 申請號: 88103725
• 申請日: 1988-06-15
• 公開（公告）號: CN88103725A
• 公開（公告）日: 1988-12-28
• 發明（設計）人: 約瑟夫·約翰·帕特羅尼;馬爾科姆·羅伊·布蘭登
• 申請（專利權）人: 邦奇(澳大利亞)有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K3/12
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 林玉貞

本發明涉及一種生物活性或自然形態蛋白質的制備方法。

重組體DNA（脫氧核糖核酸）技術為合成大量需要的真核生物（通常是哺乳動物）蛋白質提供了極有潛力和價值的手段，這些蛋白質例如有激素、干擾素和酶。雖然已經證明操縱諸如細菌類的有機體來制備所需的蛋白質是比較簡易的，但宿主機體可能不把過度生成的蛋白質產物分泌到該培養基中。因此通常就必須使該等有機體（例如細菌）產生物理或化學溶胞作用，隨后是以機械法離析出不溶性的目的蛋白質。在已有技術中，然后是采用高濃度的變性劑來進行該不溶性蛋白質的加溶，例如用尿素或鹽酸胍的水溶液（國際專利申請WP83/04418）。因此，加溶作用一直是使用得自一種多步驟方法的較純凈形態的目的蛋白質來進行。實施這些方法的投資額高，工業上實施時最好能避免使用此法。

在我們共同提出申請的澳大利亞專利申請66874/86中，申請人描述了應用一種陽離子表面活性劑從一種不溶性蛋白質源中回收一種可溶性形態蛋白質的非常有利、盡管是多步驟但很經濟的方法。然而這個方法雖可以有效地回收可溶性形態的蛋白質，活性蛋白質的最后回收率受到限制。例如，其總回收率通常是低于50%。在宿主細胞的收集，它們的溶胞作用以及蛋白質聚集物的提濃中會帶來相當大損耗，因此出現了通過物理提濃，包括差速離心在內的方法。

因此，本發明的目的是之一就是要克服或至少是減輕在已有技術中存的的一個或更多個困難。

第一個方案是提供一種回收蛋白質的方法，該方法包括提供一個包 含有一種合成的或直接獲得的蛋白質的宿主細胞來源;以及至少一種陽離子、陰離子或兩性離子表面活性劑來源;并且應用至少一種該等陽離子、陰離子或兩性離子表面活性劑，以足以產生加溶效應的量，去處理該等宿主細胞。

該種回收蛋白質的方法最好包括提供一種發酵液，其中包括含有一種合成的或直接獲得的蛋白質的宿主細胞，并且從其中離析出該等宿主細胞。該離析步驟可以應用任何適當的方法來進行。可以應用浮選、離心、過濾或超濾法。

對于許多種宿主細胞，該陽離子、陰離子或兩性離子表面活性劑還可以具有使這些細胞溶胞的作用。但是，在不能發生這種作用的場合，最好再有一個機械或化學的溶胞步驟。在這種情況下，這種處理是施加于濃縮的、比較不純的全細胞溶胞產物。

在一個位選的方案中，該宿主細胞可以受到預處理以殺死該細胞或使細胞膜變弱，以便于進行溶胞作用。

在一個優選方案中，按本發明的該回收方法進一步包括以下的同時進行的步驟：

將該等宿主細胞進行溶胞，以形成一種全細胞溶胞產物。

對于如此形成的產物溶液可以應用差速離心、分步沉淀、色譜或過濾法進行提純。這樣將可除掉諸如不溶性的不希望的污染物、不希望的細胞碎片和其他不希望的大分子物質等雜質。

關于該至少一種陽離子、陰離子或兩性離子表面活性劑的用量，要求超過它們的臨界膠束濃度。

本發明特別適用于由微生物和真核生物細胞系列所合成并經重組體DNA技術改性的具生物重要性的蛋白質的加溶與回收。所需的該種蛋白質可包括在一個宿主細胞中的一種內含體，該宿主細胞可以由一個包括該蛋白質的一個基因密碼的一種向量所轉換或轉染。

按本發明可以回收的蛋白質可以選自于單體式和聚合物式細胞內蛋白質，例如在細胞內含體和細胞質聚集物中所存在的蛋白質。該等內含體可以選自具生物重要性的多肽和肽，包括豬、牛、羊生長激素、干擾素、免疫原以及淋巴細胞活素，或者它們的非均質或均質聚合物。

該至少一種陽離子、陰離子或兩性離子表面活性劑的優選含量是約2.5-50%（重量/體積），最好是2.5-20%（重量/體積）。表面活性劑含量的上限可以變化，并且由所選表面活性劑的溶解度所限。

業已發現，有可能對包括內含體在內的全細胞所制成并含有的目的蛋白質聚集體進行加溶，方法是用一種表面活性劑在水中的溶液處理該細胞及其組分，可以有或沒有一種極性有機溶劑存在，或者只用單獨的該極性水質溶劑。這個過程可以很快（5-60分鐘），并且很容易回收該加溶的蛋白質并達到最優化的效果。只需用少量廉價并且易于得到的藥劑，并且可以循環使用。例如，該加溶劑的主體部分可以是水。