本發(fā)明涉及一種絲氨酸/蘇氨酸激酶基因在集胞藻不飽和脂肪酸合成中的應用，構建了集胞藻PCC6803中的spkD基因敲除突變株和spkG基因敲除突變株；本發(fā)明首次公開了集胞藻PCC6803中的spkD和spkG基因在改變集胞藻合成不飽和脂肪酸中的重要作用，突變株在正常培養(yǎng)條件下細胞中的C18:2、C18:3n6、C18:3n3、C18:4等脂肪酸的含量明顯低于野生型的集胞藻；spkD和spkG兩種基因在培養(yǎng)前期與集胞藻多不飽和脂肪酸的產量呈負相關，為下一步通過協(xié)同調控spkD和spkG基因表達進而提高藍藻中亞油酸、α?亞麻酸和十八碳四烯酸等多不飽和脂肪酸的含量奠定基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及一種調控集胞藻中不飽和脂肪酸合成的方法及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

藍藻(Cyanobacteria)是一類具有光合自養(yǎng)能力的原核生物。藍藻細胞能進行自養(yǎng)生長，可以不依賴外界的有機物生存，能利用簡單的無機物合成有機物為生命活動提供能量，外源基因表達產生的蛋白質能充分進行折疊、組裝，這意味著藍藻幾乎不形成包涵體，并且多數(shù)藍藻及其細胞提取物對人畜無毒，是轉基因研究的良好受體。集胞藻PCC 6803(Synechocystis sp.PCC6803)作為一種單細胞藍藻，具有結構簡單、遺傳背景簡單、易于培養(yǎng)、便于構建載體、提取物安全、細胞內蛋白酶活性低等特點，是很好的藍藻基因工程受體。

在外部環(huán)境發(fā)生變化時，藍藻依靠包括絲氨酸/蘇氨酸激酶系統(tǒng)(serine/threonine kinases system,STKs)在內的兩個主要的信號轉導系統(tǒng)迅速感知變化，并通過精準調控基因表達，使得相關代謝物發(fā)生改變，使藍藻對外界環(huán)境的變化做出積極快速的響應，從而在各種逆境中得以生存下來。

絲氨酸/蘇氨酸激酶(STK)是原核生物所必需的，它參與生長，分裂和分化等活動。STK與其同源磷酸酶一起通過催化可逆蛋白磷酸化來發(fā)揮核心作用。在感測到外部刺激后，STK經歷自身磷酸化，然后使底物蛋白轉磷酸化。特定氨基酸殘基的磷酸化可以直接控制靶蛋白的活性或間接通過調節(jié)蛋白質與蛋白質之間的相互作用來發(fā)揮作用。

多不飽和脂肪酸(PUFAs)是指含有兩個及以上的雙鍵并且碳原子數(shù)目為16-22的直鏈脂肪酸，主要包括亞油酸(C18:2，LA)、γ-亞麻酸(C18:3n6，GLA)、α-亞麻酸(C18:3n3，ALA)、十八碳四烯酸(C18:4，SDA)、花生四烯酸(C20:4n6，AA)、二十碳五烯酸(C20:5n3，EPA)、二十二碳六烯酸(C22:6n3，DHA)等。根據(jù)不飽和鍵起始于脂肪酸碳鏈甲基端的位置，利用ω(omega)-編號系統(tǒng)將多不飽和脂肪酸分為多種。具有重要功能的是ω-3類和ω-6類，其中LA、GLA、AA等屬于ω-6類多不飽和脂肪酸，ALA、SDA、EPA，DHA等屬于ω-3類多不飽和脂肪酸。

PUFAs對人體的健康具有極其重要的作用。亞油酸和亞麻酸是人體必須的多不飽和脂肪酸，它們在人體內不能合成。硬脂酸在工業(yè)和化妝品應用中較多。花生四烯酸在人體內不能大量合成。對人體最重要的是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸與其類似物。PUFAs也在動物飼料、能源行業(yè)發(fā)揮了不可替代的作用。

目前AA等脂肪酸的來源主要是肉類、奶類和雞蛋。而EPA、DHA的商業(yè)來源主要為深海魚類。但近年來深海魚類的過度捕撈導致的資源短缺大大限制了PUFAs的生產。從轉基因藍藻中提取PUFAs工藝相對簡單，藍藻相對深海魚類資源的數(shù)量可謂是取之不盡用之不竭，另外沒有特殊的異味，膽固醇含量較低。而且隨著地球環(huán)境日益變化，植物資源受地域及季節(jié)限制、環(huán)境惡化等影響越來越大，另外海洋魚類資源日益枯竭及來源于魚油的PUFAs提純過程中殘留魚腥味及氧化不穩(wěn)定性等問題，突出了藍藻可工廠化養(yǎng)殖不受季節(jié)、地域影響，藍藻資源數(shù)量豐富，生產過程無異味等生產不飽和脂肪酸的優(yōu)點。