[發明專利]β?人絨毛膜促性腺激素測定試劑盒及制作方法

在審

• 申請號: 201611161198.7
• 申請日: 2016-12-15
• 公開（公告）號: CN106596980A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 王有志;王文亮;劉衍亮;陳萍萍;宋璐琳;李紅江
• 申請（專利權）人: 威海紐普生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/76
• 分類號: G01N33/76;G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 威海科星專利事務所37202
• 代理人: 初姣姣

1.一種β-人絨毛膜促性腺激素測定試劑盒，設有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設有：PVC板、樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結合墊上吸附有稀土熒光微球標記的抗β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體-微球偶聯復合物，所述稀土熒光微球的直徑為100-250nm，稀土熒光微球含稀土鑭系元素中的一種或幾種，在基態下穩定，在300-400nm的激發光源作用下發射出波長范圍為550-650nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的β-人絨毛膜促性腺激素抗原表位的單克隆抗體細胞株。

2.根據權利要求1所述的一種β-人絨毛膜促性腺激素測定試劑盒，其特征在于所述結合墊的稀土熒光微球的直徑是120-200nm；結合墊上稀土熒光微球標記的抗體來源于針對2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株，稀土熒光微球含稀土鑭系元素Eu³⁺，在基態下穩定，在337nm的激發光源作用下發射出波長615nm的熒光。

3.根據權利要求1所述的一種β-人絨毛膜促性腺激素測定試劑盒，其特征在于所述結合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于150mM Tris-HCL處理液中(含1.0％Triton X-100，2.5％BSA，pH7.4)，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干4小時，備用，將玻璃纖維膜放在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土Eu³⁺熒光微球標記的抗β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體偶聯復合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干1小時后制得。

4.根據權利要求1所述的一種β-人絨毛膜促性腺激素測定試劑盒，其特征在于結合墊上的所述稀土熒光微球標記的β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體采用如下步驟制得：

步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：用β-人絨毛膜促性腺激素純品免疫小鼠，采用標準的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，對所獲得的單抗細胞株進行配對篩選，根據配對結果和親和力數據優選出用于試劑盒的單抗細胞株；

步驟2：單克隆抗體的制備：采用標準的腹水生產工藝制備并純化β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體，分裝后保存于-20℃備用；

步驟3：稀土熒光微球的醛基化：取5mg稀土熒光微球，用20mM，pH9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時間為5分鐘，最后重懸于100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應4小時，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃備用；

步驟4：稀土熒光微球標記的β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體的制備：選取來自2個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株的單克隆抗體，按照質量比1:1將2mgβ-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應過夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mM，4℃反應4小時；再加入等體積的封閉液(50mM Tris-HCL，pH7.4，含2％BSA，5％蔗糖)，4℃封閉過夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.4的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于100μl的50mM Tris-HCL緩沖液中(含1.2％NaCL，0.5％BSA，0.1％Tween 20)，4℃避光保存備用。

5.根據權利要求1所述的一種β-人絨毛膜促性腺激素測定試劑盒，其特征在于所述包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜通過以下步驟制得：

步驟1：采用與結合墊上所用β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體細胞株不同的細胞株，采用標準的腹水生產工藝制備并純化β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體，保存于-20℃備用；

步驟2：分別用包被稀釋液將上述鼠源抗β-人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調整濃度到1mg/ml，膜液量為1μl/cm，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質控線間隔為4mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。

6.根據權利要求1所述的一種β-人絨毛膜促性腺激素測定試劑盒，其特征在于所述樣品墊通過以下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0％Triton X-100，2.5％BSA，0.15M Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4℃浸泡4個小時，然后置于烘箱中，37℃烘干2小時。