[發明專利]一種快速檢測豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒的多重熒光RDA方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010081180.6
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN112301152A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 文荻琛;劉華勇;陳翀
• 申請（專利權）人: 廣州普世利華科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

1.一種用于檢測豬病毒的探針，其特征在于，所述探針核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6任一所示，其中核苷酸序列為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4的探針用于檢測豬偽狂犬病毒(PRV)，核苷酸序列為SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5的探針用于檢測豬圓環病毒(PCV)，核苷酸序列為SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6的探針用于檢測豬細小病毒(PPV)。

2.如權利要求1所述的檢測豬病毒的探針，其特征在于，所述探針核苷酸序列如下：SEQID NO.1或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6。

3.如權利要求2所述的檢測豬病毒的探針，其特征在于，所述核苷酸序列為SEQ IDNO.1-3所示的探針，其5’端標記發光基團，3’端標記淬滅基團，第5-10位堿基中任一位置用四氫呋喃殘基（THF）替代。

4.如權利要求2所述的檢測豬病毒探針，其特征在于，所述的SEQ ID NO.4探針5’端起第33位堿基T標記FAM發光基團，第34位堿基用四氫呋喃殘基（THF）替代，第35位堿基標記BHQ1淬滅基團，3’端進行C3-spacer阻斷修飾；所述的SEQ ID NO.5探針5’端起第33位堿基T標記CY5發光基團，第34位堿基用四氫呋喃殘基（THF）替代，第35位堿基標記BHQ2淬滅基團，3’端進行C3-spacer阻斷修飾；所述的SEQ ID NO.6探針5’端起第30位堿基T標記ROX發光基團，第32位堿基用四氫呋喃殘基（THF）替代，第34位堿基標記BHQ2淬滅基團，3’端進行C3-spacer阻斷修飾。

5.一組用于檢測偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒的靶標序列、引物對及探針，其特征在于，所述探針為權利要求2-4任一所述的探針，所述引物對核苷酸序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示，所述靶標序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。

6.一種多重檢測豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括核酸提取試劑、恒溫擴增反應模塊、陽性對照和陰性對照，以及權利要求2-4任一所述的探針及權利要求5所述的引物對。

7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的恒溫擴增反應模塊為RDA或RPA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑；所述RDA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑包括核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的重組酶KX。

8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述RDA恒溫擴增反應混合試劑的凍干粉試劑包括重組酶KX 60-600 ng/μL、KY蛋白16-192 ng/μL、單鏈結合蛋白gp32 100-1000ng/μL、鏈置換DNA聚合酶3-100 ng/μL、逆轉錄酶200U、核酸外切酶30~200U、肌酸激酶0.1-0.8 mg/ml、磷酸肌酸25-75 mM、Tris緩沖液20~100mM、PEG 2.5%-10%、醋酸鉀或醋酸鈉0-150 mM、dATP 1-5 mM、dNTPs 150-600 nM、DTT 1-12 mM、所述探針150nM-600nM、所述引物對150-600nM。

9. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的核酸提取試劑包括Buffer A、Buffer B；所述Buffer A為樣本裂解液，含有Tris-HCL緩沖體系、NaOH、SDS、EDTA、異硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；所述Buffer B含有Tris緩沖體系、氯化鉀、氯化鎂；所述陽性對照為含有豬偽狂犬病毒(PRV)gE基因、豬圓環病毒(PCV) ORF2基因、豬細小病毒(PPV)NS1基因的pUC57-X質粒，所述陰性對照為空載體pUC57質粒。

10.一種非疾病診斷目的檢測偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒的檢測方法，其特征在于，包含以下步驟：

提取待測樣品的核酸，以待測樣品的核酸為模板，在偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒的引物對、探針及RDA凍干粉試劑、Buffer A和Buffer B存在下進行實時熒光RDA反應，根據實時熒光RDA擴增曲線分析待測樣品；其中所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示; 其中反應溫度為25-42℃，反應時間大于10分鐘。