[發明專利]一種快速檢測豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒的多重熒光RDA方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202010081180.6
• 申請日: 2020-02-06
• 公開（公告）號: CN112301152A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 文荻琛;劉華勇;陳翀
• 申請（專利權）人: 廣州普世利華科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
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本發明公開一種快速檢測豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的RDA方法及試劑盒，包括特異性引物組以及RDA熒光標記探針，以實現對豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒的安全、特異、靈敏、簡便的檢測，從而彌補現有傳統檢測技術的不足。本發明中提供的試劑盒可省去核酸提取步驟，在恒溫條件下20min內實現對三種病毒的檢測，特異性為100％，與普通PCR方法相比，RDA熒光法在恒溫下反應，不需變溫，不需復雜儀器，而且反應時間短，適用于現場快速檢測。本發明的方法及其試劑盒具有操作簡單、快速、特異性好、靈敏度高、成本低廉等特點，可為豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒現場快速檢測篩查提供有效的技術手段，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域。更具體地，涉及一種基于多重RDA熒光法檢測技術檢測豬偽狂犬病毒(PRV) 核酸、豬圓環病毒(PCV) 核酸、豬細小病毒(PPV)核酸的引物、探針及相關試劑盒。

背景技術

豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV)、豬細小病毒(PPV)是引起豬多系統疾病的常見病原，經常混合感染，診斷和防治比較困難，是危害養豬業最為嚴重的幾種病原，是世界各國的重點防控疫病，也是我國養豬場檢疫凈化的主要對象。目前，針對上述幾種豬病病原建立了多種分子檢測技術，如PCR和熒光PCR技術等，在這些疫病的診斷和防控中發揮了重要作用。然而目前分子生物學的檢測大多基于PCR，檢測時需要依賴PCR儀或昂貴的實時定量PCR儀，及其它多種配套設備，需配備專門的PCR實驗室和專業操作人員，其成本和應用范圍均受到一定限制。隨著體外核酸恒溫擴增的悄然興起，傳統擴增技術的局限性有所改變，在過去的十年中，使核酸體外擴增變得更加簡單和方便的一些等溫核酸擴增技術已得到快速發展，如LAMP（環介導核酸擴增技術）、HDA（解旋酶依賴等溫核酸擴增技術）等均可在等溫條件下擴增核酸模板。這些技術只需要溫度控制裝置來保持一個恒定反應溫度，就可以實現高效的核酸擴增，從而得以擺脫對精密控制溫度變化的 PCR 儀的依賴。若能在更低的溫度條件下，甚至在常溫條件下實現核酸的擴增，將進一步使核酸擴增技術簡單化，并有利于此類技術更廣范圍的應用。

及時準確地發現傳染病疫情對于疾病的防治和疫情的控制具有重要意義，因此研究和開發一種能在常溫下多重特異性檢測豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV) 、豬細小病毒(PPV)的試劑盒非常有必要。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有對豬偽狂犬病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒檢測技術的缺陷和不足，提供了一種能同時檢測豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV) 、豬細小病毒(PPV)三種核酸的多重RDA熒光法檢測試劑盒，實現對豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV) 、豬細小病毒(PPV)的快速檢測。本發明在檢測PRV、PCV、PPV的整個過程中，從樣本處理到結果完成，僅需20-30min，大大縮短了常規的檢測時間，提高檢測效率。

本發明目的在于，提供優選后的用于檢測豬病毒的探針，所述探針核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6任一所示，其中核苷酸序列為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4的探針用于檢測豬偽狂犬病毒(PRV)，核苷酸序列為SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5的探針用于檢測豬圓環病毒(PCV)，核苷酸序列為SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6的探針用于檢測豬細小病毒(PPV)。

本發明另一個目的在于，提供優選后的同時檢測豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV) 、豬細小病毒(PPV)的靶標序列、引物對及探針。

所述檢測豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV) 、豬細小病毒(PPV)的探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6所示。