[發明專利]檢測胰島素與白蛋白結合活性的方法

在審

• 申請號: 202110342714.0
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113466466A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 楊子蘭;劉國良;謝燦;郭林峰;馮艷;徐軍;李曉平;陳小鋒;李文佳
• 申請（專利權）人: 廣東東陽光藥業有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/74;G01N21/64
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

1.一種細胞裂解液，其特征在于，包括：0.4％～5％Triton X-100，100～200mM NaCl和25～75mM HEPES。

2.根據權利要求1所述的細胞裂解液，其特征在于，包括：0.5％～5％Triton X-100，150mM NaCl和50mM HEPES，優選地，0.5％～2％Triton X-100。

3.根據權利要求1所述的細胞裂解液，其特征在于，進一步包括酶抑制劑，所述酶抑制劑包括蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑或其混合物；

任選地，所述蛋白酶抑制劑包括絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑以及金屬蛋白酶的抑制劑的至少之一；

任選地，所述磷酸酶抑制劑包括酪氨酸磷酸酶抑制劑、絲氨酸或蘇氨酸磷酸酶抑制劑、酸性磷酸酶抑制劑和堿性磷酸酶的抑制劑的至少之一；

任選地，所述酶抑制劑包括選自釩酸鹽或過氧釩、抑肽素、亮肽素、PMSF或AEBSF、Blocking reagent、Halt^TMProtease and Phosphatase Inhibitor Cocktail的至少之一。

4.一種試劑盒，其特征在于，包括權利要求1～3中任一項所述的細胞裂解液。

5.權利要求1～3中任一項所述的細胞裂解液在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于檢測蛋白磷酸化活性。

6.一種檢測細胞蛋白磷酸化活性的方法，其特征在于，包括：

利用權利要求1～3中任一項所述的細胞裂解液對待測細胞進行裂解；

將裂解上清液進行酶標檢測，以便獲得熒光值；

基于熒光值-蛋白磷酸化活性對應曲線，獲得所述蛋白磷酸化活性。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解是在溫度為20-30℃、轉速為250rpm-400rpm的條件下進行30-90min。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述待測細胞和所述細胞裂解液的個數體積比為(1～3*10⁴)個：(50～100)μL，優選，2*10⁴：(50～100)μL。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶標檢測以337nm為激發波長，檢測665nm、620nm的熒光值。

10.一種檢測胰島素與白蛋白結合活性的方法，所述胰島素具有脂肪酸修飾，其特征在于，包括：

利用待測胰島素與白蛋白的混合溶液對細胞進行刺激；

利用權利要求6～9所述的方法對刺激后的細胞進行處理，以便獲得所述細胞的胰島素受體磷酸化活性；

基于所述胰島素受體磷酸化活性，確定所述胰島素與白蛋白結合活性；

任選地，所述刺激是在37℃、5％CO₂的條件下進行5min；

任選地，所述細胞預先進行無血清培養基饑餓處理；

任選地，所述細胞在所述培養板中的密度為3～9*10⁴個/cm²，優選，6～7*10⁴個/cm²。