[發明專利]檢測胰島素與白蛋白結合活性的方法

在審

• 申請號: 202110342714.0
• 申請日: 2021-03-30
• 公開（公告）號: CN113466466A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 楊子蘭;劉國良;謝燦;郭林峰;馮艷;徐軍;李曉平;陳小鋒;李文佳
• 申請（專利權）人: 廣東東陽光藥業有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/74;G01N21/64
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 肖陽

本發明提出了一種細胞裂解液。該細胞裂解液包括：0.4％～5％Triton X?100，100～200mM NaCl和25～75mM HEPES。該細胞裂解液利用Triton X?100這種溫和型的非離子表面活性劑作為裂解液的主要成分，可以破壞細胞膜，但對細胞核膜的作用較弱，既能達到細胞裂解的作用，又不會使基因組等復合物釋放出來，避免透明膠狀物的產生，從根源上解決液體粘稠及實驗數據誤差大的問題。該細胞裂解液特別適用于細胞蛋白磷酸化檢測中對細胞樣品的裂解處理。

技術領域

本發明涉及生物醫藥檢測領域，具體地，本發明涉及細胞裂解液、試劑盒、檢測細胞蛋白磷酸化活性的方法以及檢測胰島素與白蛋白結合活性的方法。

背景技術

脂肪酸修飾的胰島素與白蛋白的可逆性結合和解離，緩慢釋放出胰島素，延緩胰島素對胰島素受體的磷酸化作用。胰島素的脂肪鏈與白蛋白可逆性結合，延長作用時間，是胰島素延遲作用機制之一。因此，通過檢測胰島素受體的磷酸化活性，可用來評估脂肪酸修飾胰島素與白蛋白的結合活性。

發明內容

本申請是發明人基于對下列問題的發現和認識所作出的：

現有檢測細胞蛋白磷酸化的試劑盒中的裂解液作用劇烈，裂解細胞的過程中釋放出細胞中的基因組等復合物，使裂解產物中出現了團狀透明膠狀物，且現有試劑盒中的裂解液的對細胞的裂解效果易受反應溫度、轉速、裂解液體積等因素的影響，該裂解液的裂解作用呈現一定的不穩定性。此外，裂解后粘稠液體非常不便于轉移，且易于被轉移至反應體系，從而造成待測刺激化合物，如胰島素，復孔間的CV值偏大、反應曲線的擬合度差。

針對現有檢測細胞蛋白磷酸化的試劑盒中裂解液裂解效果不穩定，本發明提出一種新的細胞裂解液配方。利用Triton X-100這種溫和型的非離子表面活性劑作為裂解液的主要成分，再結合試劑盒的裂解抑制劑，替代試劑盒中的強裂解液，可以破壞細胞膜，但對細胞核膜的作用較弱，既能達到細胞裂解的作用，又不會使基因組等復合物釋放出來，避免透明膠狀物的產生，從根源上解決液體粘稠及實驗數據誤差大的問題，本方案易于操作，穩定性及重復性好。

在本發明的第一方面，本發明提出了一種細胞裂解液。根據本發明的實施例，所述細胞裂解液包括：0.4％～5％Triton X-100，100～200mM NaCl和25～75mM HEPES。根據本發明實施例的細胞裂解液利用Triton X-100這種溫和型的非離子表面活性劑作為裂解液的主要成分，可以破壞細胞膜，但對細胞核膜的作用較弱，既能達到細胞裂解的作用，又不會使基因組等復合物釋放出來，避免透明膠狀物的產生，從根源上解決液體粘稠及實驗數據誤差大的問題。根據本發明實施例的細胞裂解液特別適用于細胞蛋白磷酸化檢測中對細胞樣品的裂解處理。

根據本發明的實施例，上述細胞裂解液還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，所述細胞裂解液包括：0.5％～5％Triton X-100，150mMNaCl和50mM HEPES，優選地，0.5％～2％Triton X-100。進而細胞可完全裂解，且裂解后的液體沒有粘稠現象出現。

根據本發明的實施例，進一步包括酶抑制劑，所述酶抑制劑包含但不限于蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑或其混合物，可以有效抑制細胞裂解后各種蛋白酶的活性，防止蛋白質水解，也能更好的保護磷酸化的蛋白，保持其完整性和天然活性。其中蛋白酶抑制劑通常包括絲氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶以及金屬蛋白酶的抑制劑，磷酸酶抑制劑通常包括酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸、酸性和堿性磷酸酶的抑制劑。