[其他]重組人類白細胞介素-2的提純

無效

• 申請號: 85103306
• 申請日: 1985-04-30
• 公開（公告）號: CN85103306A
• 公開（公告）日: 1987-05-27
• 發明（設計）人: 希格擴·亞瑪扎凱
• 申請（專利權）人: 弗·哈夫曼-拉羅徹有限公司
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;A61K35/14;//;C12R191)
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣,辛敏忠

人體白細胞介素-2（IL-2），從前稱做T細胞生長因子（TCGF），是一種可溶性蛋白，可以從被外源凝集素或抗原激活的T細胞中獲得，它具有調節淋巴細胞反應性的功能，并有助于對抗原特異的效應性T淋巴細胞的體外長期培養。還知道IL-2具有增加胸腺細胞有絲分裂和誘導細胞毒性T淋巴細胞的反應。據此，這種淋巴細胞調節物質對增強體液和細胞免疫應答及把免疫缺陷狀態恢復到正常的體液及細胞免疫狀態是有作用的。這些被確認了的IL-2的免疫學活性指明，IL-2在醫學免疫治療免疫性疾病，包括腫瘤疾病，細菌或病毒感染，免疫缺陷病，自身免疫病等等時是有用的（佩珀馬斯特·B等人;免疫藥理學進展，507.1980）。最近，在美國醫學會的雜志第249卷第2期第166～171頁（1983年1月14日）上的一篇綜述性文章中，討論了各種不同的淋巴因子，特別包括了人體的IL-2的臨床應用。

最近已從應用多步驟的高效能的液相層析（HPLC）法，把由誘導的人體惡性細胞中獲得的IL-2提純為均質性物質。這種均質性的人體IL-2顯示出了一種每毫克為1.4×10⁶單位的特殊活性（例如，參見歐洲專利申請號83.109202.8，公開號106179）。

塔尼古奇（Taniguchi）等人于1983年2月9日在賓西法尼亞州費城的第三屆重組DNA（脫氧核糖核酸）年會上，報道了IL-2基因的克隆化和其順序的排列，并且還報道了人體IL-2的不成熟型式的表達（“自然”，302期305～310〔1983〕）。IL-2蛋白體氨基酸序列是由cDNA（互補DNA）而來，此cDNA是從由刀豆球蛋白A誘導的Jurkat細胞中得到的mRNA（信使核糖核酸）中制備出來。整個cDNA克隆長為800個堿基對，編碼一種153個氨基酸的蛋白質。同樣參見歐洲專利申請。公開號91539。

其他小組也報道了IL-2基因的克隆化和其順序的排列。見德沃斯（Deves）等人所寫的“人體IL-2cDNA的分子克隆化及其在大腸桿菌F.coli中的表達”。“核酸研究”。1983年11卷4307～4323頁。還可見歐洲專利申請，公布號118977。

盡管這些參考資料描述了IL-2在轉化的宿主細胞中，特別是在E.coli中的表達，但都沒有公開過使該技術領域的專業人員能夠獲得均質的或基本上純凈的成熟的重組人體IL-2的純化過程。

本發明是一種純化重組IL-2特別是重組的成熟的人體IL-2的方法。本發明提供了一種提純重組的成熟的人體IL-2使之達到均質性的方法，該方法克服了先有的提純方法的局限性。這個方法包括：

（1）培養一種含有可能編碼出成熟的人體IL-2的DNA序列的轉化的生物體。

（2）制造一種（1）步驟中轉化的生物體的培養以表達和積累成熟的人體IL-2。

（3）溶解（2）步驟已轉化的生物體的培養物以得到一種細胞溶胞的混合物。

（4）把細胞膜成分從步驟（3）中的細胞溶胞混合物中分離出來。

（5）用提取液清洗分離出的細胞膜成分以得到含有IL-2的洗液。

（6）用層析法純化（5）步驟的洗液以得到基本上純凈的或均質的重組人體IL-2。

本發明的附圖的簡介如下：

圖1描繪了pIL2-2B的DNA核苷酸序列及相應的成熟的人體IL-2的氨基酸順序（箭頭代表成熟的IL-2蛋白質的氨基末端。

圖2以圖的方式解釋了從pBR322來的pRC2的結構。

圖3圖解了含有一個P_L啟動子的pRC23的結構。

圖4表示了為表達Ser-IL-2的結構基因的構成。

圖5圖解了一個不帶啟動子系統（pRC201/IL-2）的成熟的IL-2表達載體的結構。

圖6圖解了含有一個P_L啟動子系統（pRC233/IL-2）。

本發明的過程是依賴于出人意外地發現了由微生物所表達的IL-2蛋白質傾向于伴隨著宿主微生物的膜碎片，主要是微生物的內膜（脂質雙層膜通常伴有疏水蛋白質）。因而，在重新獲得IL-2的過程中把這些膜從轉化微生物中分離，保證了在整個提純過程的最后時刻獲得高產和純凈水平的IL-2。

雖然本發明的過程中可以應用不同的已知的細胞溶解的方法，如酶解或化學溶解，但最好用超聲波破碎方法。然后用已知的方法如離心方法把細胞的外膜及內膜同其他細胞成分分開。