[其他]用細菌培養生產透明質酸

無效

• 申請號: 85103674
• 申請日: 1985-05-13
• 公開（公告）號: CN85103674A
• 公開（公告）日: 1986-11-12
• 發明（設計）人: 布雷克;撒克爾
• 申請（專利權）人: 戴格諾斯蒂克公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04;A61K31/725;//
• 代理公司: 上海專利事務所
• 代理人: 顏承根

透明質酸是從生物中提取的一種粘多糖體。已發現其在緩沖生理鹽水中鈉鹽即透明質酸鈉，在眼科手術及其他醫學應用中可作為玻璃體的替代物有重要用途。在美國專利4141，973及4，328，803中已描述了一些在這方面的應用。為了這類醫學上的目的，到目前為止曾經使用了分子量超過75萬的無熱原高純度透明質酸鈉。由新澤西州Piscataway的Pharmacia公司生產的名為“海龍（Healon）”的商品是為這類目的而出售的透明質酸鈉的1%溶液。例如，據報道烯海龍液（含0.1-0.2%的透明質酸鈉）眼藥水。作為治療干性角膜炎綜合癥很有用。透明質酸還用于試管培養麻瘋桿菌作為配料及用作化妝品配方中的一種成份，這在美國專利4，303，676中說明的配方中既包括低分子量組份（約10～5萬）又包括較高的分子量組份（超過1百萬）。所有上述用途的透明質酸的來源為公雞之冠，人的臍帶或其他脊椎動物的組織。從這類組織中提取并提純的透明質酸價格非常昂貴。用鏈球菌的A組和C組菌株能夠生產透明質酸。曾經報道的作為細菌產品的一種用途是在人的血清中測定抗鏈球菌的透明質酸酶時作為試劑的，參見Kjems及Lebech在斯堪納維亞病理學微生物學學報B部分84：162-164（1976）一文。在該論文中作者敘述了培養A組鏈球菌的限定配方的培養基，報道的產量為每公升培養肉湯中可分離出透明質酸0.3克。然而用細菌生產的透明質酸還未發現有實質上的用途，因為該酸屬于低分子量范圍。

本發明提供的用細菌源生產的透明質酸，其分子量范圍比在先有技術中已報道過的用細菌源生產出的透明質酸的分子量范圍更高。本發明提供的方法，其產量也比以前報道過的大大提高。該方法另外還生產醫用的、純度可與現有的相比擬或更好的透明質酸。雖然在典型情況下用本方法生產的透明質酸具有的平均分子量約為五萬五千，但作為眼藥水的成份及化妝品配方的成份，它有潛在的重要用途。用本發明的方法生產的透明質酸產量高、純度高、成本低，因而可用于以前沒有敘述過的地方，或是用哺乳類動物源或低產量的細菌源所生產的透明質酸未曾打算用的地方。例如透明質酸可以在食品加工中用作致濕劑，其他應用方面，有作為潤滑劑，及在外科手術后用來減少由于纖維化反應及/或粘連形成所引起的并發癥。該材料還可以用于回收第三紀原油時作為聚丙烯酰胺的代用品，類似的合成聚合物或從生物中生產出的聚合物。

本發明的方法的最佳形式包括在無氧條件下在二氧化碳富集的生長培養基（其中包括用細菌生產透明質酸所需的那些原料）中培養出可生產透明質酸的鏈球菌菌種。雖然不是必需殺死細菌但最好殺死細菌，將細菌與生長培養基分離，在離析出透明質酸。最好在肉湯培養基分離，再離析出透明質酸。最好在肉湯培養基中發酵使細菌生長。其他生長技術及培養基都可以使用。例如可以用瓊脂培養基。所以“生長培養基”一詞在此可以廣義地指液體或固體培養基或兩者的組合，且發酵之外的其其他生長方式，在技術上是眾所周知的。

雖然本發明的最佳方式是設想在可產生透明質酸的培養基中直接生長細菌，但也可以在其他生長培養基中生長細菌，將細菌與培養基分離，在緩沖懸浮液或蒸餾水中再懸浮細菌，并在懸浮液中加適當的原料以便用已經生長細菌生產透明質酸。這種被看作為與最佳方法相同的工藝僅包括使用靜止的細胞懸浮液。因而此處“使培養物生長”等詞都應當作是包括在其范圍中的兩種手段。

與以前透明質酸的生產方式不同，在接種前可以通過1萬（10K）額定分子量限制截止過濾器如微孔聚胺膜盒式切向流過濾系統來濾掉所有成份，從一開始就將內毒素從系統中排出，其后維持無熱無氧的生長條件。

在本發明的最佳實施例中，使用了諸如含有以下成份的半限定生長培養基：

1.酪蛋白水解液，酶催性????20.0克

2.氯化鉀????3.0克

3.磷酸鈉，二代性????2.8克

4.硫酸鎂（7H₂O） 0.5克

5.氯化鈣（2H₂O） 10.0毫克

6.葡萄糖????20.0毫克

7.維生素溶液

A）D-生物素????2.0毫克

B）D-泛酸鈣????1.0毫克

C）氯化膽堿????1.0毫克

D）葉酸????1.0毫克

E）I-肌醇????2.0毫克

F）煙酰胺????1.0毫克

G）鹽酸吡哆醛????1.0毫克

H）核黃素????0.1毫克

I）鹽酸硫胺素????1.0毫克