[其他]從產生蛋白質的培養基中提取和凈化蛋白質的方法

無效

• 申請號: 86101798
• 申請日: 1986-03-19
• 公開（公告）號: CN86101798A
• 公開（公告）日: 1986-10-15
• 發明（設計）人: 范·威杰南戴爾·弗蘭斯;吉勒斯·丹尼爾;西蒙內特·蓋伊
• 申請（專利權）人: 史密斯克來林-RIT公司
• 主分類號: C07K3/26
• 分類號: C07K3/26
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 劉元金

本發明敘述了從產生蛋白質的培養基中提取和凈化蛋白質的一種改進的方法，更確切地說，本發明講述了，在采用重組脫氧核糖核酸技術從受控細胞培養物中，或更確切地說，從受控酵母菌株培養物中產生肝炎B病毒表面抗原和α-1-抗胰蛋白酶時，如何提取和凈化肝炎B病毒抗原和α-1-抗胰蛋白酶的方法。

在各種微生物中，細菌和酵母可被用作含有一個脫氧核糖核酸分子的不同質體的寄主生物，這種分子包含一種特定蛋白質的核苷酸順序編碼。在這些微生物中，酵母是目前最好的和通用的。例如，歐洲專利申請說明書0106828號公開了使用釀酒酵母生產肝炎B病毒表面抗原（HBsAg）的方法，歐洲專利申請說明書0103409號也敘述了用酵母質體生產α-1-抗胰蛋白酶的方法。

用酵母菌株中生產蛋白質比用細菌菌株中生產蛋白質具有更多的優點。這些優點來自以下二方面，第一，酵母在大規模發酵器中較易生長，第二，酵母在新合成的蛋白質上增加碳水化合物基團的能力和哺乳動物細胞相似，而細菌則沒有這種能力。

由于酵母細胞的化學成分相當復雜，特別是為了改進多肽的生產率而延長酵母生長期，結果使脂質含量增高時，從酵母培養物提取和凈化蛋白質就出現了一些技術問題。

例如，酵母屬細胞壁被認為由三層組成：（a）不溶于堿的β-葡聚糖內層，（b）可溶于堿的β-葡聚糖中層和（c）糖蛋白外層，其中碳水化合物含有磷酸化的甘露聚糖;細胞壁下面是一層細胞質膜，此膜系由中性脂質（單一、二、和三甘油酯）、游離的和酯化的甾醇、一種復雜的神經鞘脂類、甘油磷脂以及中性的和酸性的糖脂等組成的一種非常復雜的混合物;核含有脫氧核糖核酸、各種核糖核酸和一種多聚磷酸鹽;空泡含有許多高分子量和低分子量的成分，他們是作為許多水解酶的貯存泡;線粒體富含脂質、磷脂和膜系統的麥角甾醇成分;細胞質則含有大量的核蛋白體、多聚磷酸鹽、糖原和許多糖酵解酶。大多數酵母細胞（例如酵母屬菌株）也含有一些小球形的脂質，延長培養期，其量會增加。

已經公開了一些用于提取和凈化不同來源的蛋白質的多步驟工藝程序。例如關于從受控微生物產生蛋白質的出版物有以下一些：斯塔海倫（Th.Staehelin）等人（J.Biol.Chem.256;9750-54;1981），默里（K.Murray）等人（The????EMBO????J.3;P.645-650;1984）和希茨曼（R.A.Hitzeman）等人（Nucl.Ac.Res.11;2745-2763;1983）的文章。

典型的是，當產生的蛋白質與細胞結合時，那些不同的方法包含三個步驟系列。

在第一步驟系列中，所需要的蛋白質是從細胞內部脫除。因此，細胞或者被溶解（例如通過酶處理）或者被破碎（例如通過剪切力那樣的機械力，例如X-壓力機或法國壓力機）或同玻璃珠一起搖動，最后加入一種洗滌劑（見默里等人以及希茨曼等人在上述參考文獻中所述）。

在第二步驟系列中，培養基在所需要的蛋白質中富集，例如通過加入硫酸銨和（或）在聚乙二醇存在下進行分段沉淀。

最后，在第三步驟系列中，實際上全部污染物都從培養基中被去除，例如，采用下述一種或幾種方法，這些方法包括超濾、離子交換、凝膠過濾色譜和等密度梯度離心分離。

在這一工藝程序中，顯然，隨同蛋白質（希茨曼等人所述，在上述引文中）、核酸和脂質，更準確地說高的脂質含量等污染物，對第三系列步驟中的至少一步驟（例如超濾和柱色譜法）具有有害的影響，而且蛋白酶必須從培養基中快速除去。此外，由于脂質會干擾沉淀，因此如不預先進行粗脫脂，則用硫酸銨沉淀是不可能的。

因此，最重要的是安排一種方法，該方法可以在第三步驟系列前消除大部分污染物。

在某些上述方法中，使用了聚乙二醇作為蛋白質的選擇性沉淀劑，還有報告提及用脂蛋白-多陰離子-金屬相互作用以從血漿中沉淀脂蛋白的方法。

波爾森（Polson）等人（Biochem.Biophys.Acta????82;463-475;1964）曾提出使用可溶于非離子水的聚合物，更明確的說是聚乙二醇（PEG）、來分段沉淀蛋白質的方法，并由不同的作者進行了討論。其中霍尼格（W.Honig）等人（Analyt.Biochem.72;502-512;1976）提及“通過使用比通常應用的聚乙二醇6000平均分子量更低的聚乙二醇組分可以改進沉淀的專一性，即所需要的蛋白質和總蛋白質的比例”。然而，作者又講，“雖然通過控制pH，可以得到某種血漿蛋白質的濃縮物，但是，對更復雜的蛋白質混合物，例如細胞勻漿的上層清液來講，凈化的效果是相當差的”。