[其他]包新形狀顆粒高免疫原性乙肝表面抗原的制備方法

在審

• 申請號: 86102113
• 申請日: 1986-03-31
• 公開（公告）號: CN86102113A
• 公開（公告）日: 1986-11-19
• 發明（設計）人: 阿爾夫里德·梅爾·普倫斯;克旺格·索·基姆
• 申請（專利權）人: 紐約血中心公司;尤金泰克國際公司
• 主分類號: A61K39/29
• 分類號: A61K39/29;A61K9/14
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 辛敏愚,顧柏棣

本發明是關于一種可用作為疫苗或疫苗中間體的顆粒溶液或懸液。本發明是關于含有新形狀顆粒、高免疫原性乙肝表面抗原制備的方法。本發明涉及含有該物質的抗原的滅活過程，滅活是通過加熱于高濃度抗原性物質而完成的，高濃抗原性物質就是指在其中不需加入諸如白蛋白之類的蛋白質給以稀釋的意思。本發明是關于該抗原組合物制備的方法，此抗原組合物可用于免疫動物，尤其是可免疫人類。

多年前，Alyred????M.Prince對于乙肝表面抗原和乙肝病毒的關系曾明確的給以闡明（Pro.Nat.Acad.Sci.U.S.，60：814-821，1968）。此抗原主要位居埋于脂蛋白顆粒的膜蛋白上，此脂蛋白顆粒具有大小約為18-24納米的顆粒和同樣大小直徑的絲狀物。現知，這些顆粒和絲狀物形成膜的片斷相當于乙肝病毒粒子的圍繞物，也就是“Dane”顆粒。

此后，Blumberg????etal.在美國專利中（專利號：3，636，191），公布了含有這種顆粒的疫苗。以后，Prince????etal.公布了另一種乙肝病毒疫苗，此疫苗含有由“Dane”顆粒和絲狀物而來的膜蛋白。這些“Dane”顆粒和絲狀物相當于乙肝e抗原或與乙肝e抗原有關，乙肝e抗原見于許多慢性乙肝病毒攜帶者體內。

由于上述工作的開展，在美國采用了抗乙肝病毒的疫苗，此疫苗含有乙肝表面抗原顆粒。此疫苗是由慢性乙肝病毒感染病人的血漿中取得含顆粒的乙肝表面抗原，再以酶消化法制備而成，上述美國專利（專利號：3，636，191）中對此有些敘述。該疫苗是以耗資巨大的純化過程制備而成，并造成大量免疫原性的丟失。其結果，為了保證有足夠的免疫反應，就必須加大所制成的抗原（乙肝表面抗原）的劑量。因為這些因素，使用該疫苗時，其價格相當昂貴，每個劑量約需30美元或更高。因為免疫時必須有初次注射和二次加強注射，故在美國，抗乙肝病毒免疫開支約為100美元。像這樣的開支，在世界上需要疫苗數量十分巨大的那些國家和地區是負擔不起的。

因此，提供一種含乙肝表面抗原的、本質上更純形狀的、具有大大增強免疫原性的乙肝疫苗成為人們所期望，以便可以使用更小的劑量和較少的開支。當然，同樣重要的是感染性病毒進入血漿之始必須是完全滅活的，以保證無感染之危險。

乙肝感染大部分是涉及居住在亞洲和非洲發展中國家的人們，這些國家用于公共衛生事業基金有限。在20世紀，提供這樣一種疫苗，保護億萬人民免遭乙肝病毒的感染，繼而免遭續發的肝硬變和肝癌的危險，而且提供疫苗的費用又是人們可以負擔的起的，這確是一件迫切而有意義的事。在許多發展中國家，假若使用疫苗，其免疫費用必須在每人1美元以下。

在共同未決專利申請中（專利申請號：656833）公布了一個制備疫苗或疫苗中間體的方法，此疫苗或疫苗中間體的特征在于含顆粒乙肝表面抗原極大限度地轉變為一種在自然界尚未見過的新形態，這些新形狀驚人地加強了免疫原性。

根據在那里報告的實驗，含該物質的高濃度乙肝表面抗原的制備步驟是：

1.由血漿中沉淀乙肝表面抗原，例如，人血漿中含有乙肝表面抗原，加入聚乙二醇將乙肝表面抗原與血清中所含的其它血清蛋白分離開;

2.將分離得到的乙肝表面抗原通過羥基磷灰石柱的負吸附作用，進一步除去大部血清蛋白;

3.將負吸附的乙肝表面抗原經等密度離心處理，以分離存留下的完整的“Dane”顆粒并進一步除去殘存、夾雜的血清蛋白;

4.將離心分離得到的顆粒經加熱滅活處理，顆粒加熱處理時的濃度為0.5-10mg/ml，溫度為101-104℃，2-5分鐘。此后，將加入顆粒冷卻，例如，將顆粒通過冷水浴冷卻。

上述第四步驟中加熱滅活的一步必須要使蛋白質濃度不斷處于穩定之中，以避免顆粒的變性。

現已令人驚奇地發現，上述第三步得到的物質可以在不加入任何乙肝表面抗原穩定劑的條件下加熱滅活，即在含顆粒的乙肝表面抗原中不加入諸如白蛋白之類物質的稀釋劑。還進一步發現，加熱滅活不僅提供一個不含白蛋白的組合物，而且這一組合物具有新的乙肝表面抗原的形態樣式，易于以電子顯微鏡觀察。

可以相信，血清中存在的其它病毒（例如人類血清），以同樣的滅活方法可得到其它抗原體尤其是病毒的高濃抗原性組合物，假若對病原體的滅活是按照本發明的方法，即：不加入諸如辛酸鈉穩定的白蛋白穩定劑的方法，此高濃抗原性組合物還可作為疫苗或疫苗中間體使用。應注意到：提供一個盡可能純的疫苗，即：幾乎含外源蛋白（如：白蛋白）是有很大優點的。