[其他]從全發酵啤酒回收細胞外酶的方法

無效

• 申請號: 86106017
• 申請日: 1986-09-03
• 公開（公告）號: CN86106017A
• 公開（公告）日: 1987-04-08
• 發明（設計）人: 杰克·威廉·布魯爾;查爾斯·埃弗雷特·布拉澤斯;特里·弗雷德·法弗金宗烈;李恩圭
• 申請（專利權）人: 邁爾斯實驗室公司
• 主分類號: C12N9/50
• 分類號: C12N9/50;C12F3/06
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 王巍,曹恒興

本發明是1985年9月4日提出的美國專利申請號775，031的繼續部分。

眾所周知，工業用酶的生產是采用在含水營養培養基中培養微生物的方法，例如培養細菌、真菌和酵母。根據特定微生物的性質，生產的酶（類）可能是細胞外的、細胞內的或它們的混合物。當產生的酶（類）是細胞外的，一般要得到它們首先將含酶上清液從微生物細胞中分離出來，然后用眾所周知的方法，如沉淀、超濾和蒸發作用，從上清液中回收酶（類）。當產生的酶（類）是細胞內的時，首先，它們必須從細胞中脫離，這可以通過化學方法和/或機械方法來完成。一旦酶（類）放入溶液中，它們還可以采用上述已知方法進行回收。

已知細胞外酶的組分和性質是不同于細胞內酶的，例如，細胞外酶的分子量一般比細胞內酶顯著地要低。含有從細胞中脫離的細胞內酶的溶液，還包含大量其它胞內物料，這些物料不存在于含有細胞外酶的全發酵啤酒中。這些不同處可以形成對于它們的回收和純化應用不同的工藝過程，甚至當它們都在水溶液中時亦如此。顯然，適宜于細胞內酶的回收工藝過程對細胞外酶是無用的。

為了改進生產和回收酶的效率和方便起見，已知可在含有聚乙醇和葡聚糖混合物的兩相營養培養基中進行微生物發酵來生產酶。當發酵完成時，細胞外酶富集在面層聚乙二醇相中，而細胞和其它發酵產物富集在底層的葡聚糖相。這在《酶和微生物工程學》第7卷、333-338頁（1985年）中已敘述了。在該體系中α-淀粉酶的分配系數有一個最大值，例如為4。

在美國專利4，508，825號中敘述了上述工藝過程的變化。其中，含細胞外酶上清液與細胞分離，無細胞上清液與聚乙二醇和陽離子表囟代醇/聚胺共聚物或葡聚糖聚合物混合，以形成兩相。這種技術可以用來分離胞外蛋白酶和淀粉酶，其中蛋白酶富集在聚乙二醇相，淀粉酶富集在陽離子共聚物或葡聚糖相。

兩相酶回收工藝過程也用于細胞內酶的回收，美國專利4，144，130號敘述了應用：（1）未被取代的或取代的高分子量聚乙醇、聚醚、聚脂、聚乙烯吡咯烷酮或聚糖和無機鹽的混合物，或（2）至少有兩種上述高分子量聚合物的混合物，從水溶液回收細胞內酶，細胞內酶是從細胞中釋放出來進入水溶液的。例如，當應用聚乙二醇和無機鹽混合物時，所需細胞內酶進入面層聚乙二醇，而細胞碎片和其它發酵產物進入較低的含鹽層。當處理全發酵啤酒時，在1，2-乙二醇中回收的各種酶的分配系數大約為0.3。當凍結細胞與水混合并被分離釋放出酶時，分配系數約僅增加3。

美國專利4，016，039號公開了增加聚乙二醇使無機鹽加速無細胞上清液中酶的沉淀。

在已有技術中沒有任何跡象表明，聚乙二醇和無機鹽可應用在兩相方法中而從分配系數至少50的全發酵啤酒回收細胞外酶。

根據本發明提供的從全發酵啤酒回收細胞外酶的工藝過程，包括（a）選自下列種類的聚合物：聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸鹽衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸鹽衍生物、聚（1，2-亞乙基二醇）酯、聚乙烯亞胺、三甲氨-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它們的混合物，和（b）無機鹽的混合物，加到含有微生物細胞和細胞外酶的全發酵啤酒中，全發酵啤酒-聚合物-鹽混合物可以分離成富酶的聚合物相和貧酶的鹽相，并從此回收富酶產品。

在上述技術中已知本發明的工藝過程用含有細胞外酶的全發酵啤酒作為原料。例如已知用地衣芽孢桿菌Amyloliquefaciens桿菌枯草桿菌和毛霉菌屬miehei在適宜的營養培養基中生長，生產細胞外酶，如蛋白酶、淀粉酶和微生物粗制凝乳酶。在本發明的方法中可應用由細胞碎片、可溶細胞外酶和其它發酵產物形成的混合物，沒有從可溶酶進一步分離細胞碎片。應用在此處的術語“細胞碎片”指的是整個細胞以及細胞片段。

然后，全發酵啤酒與聚合物和無機鹽混合形成兩相系。所需的細胞外酶集中在聚合物相，而細胞碎片集中在鹽相。

適宜的聚合物包括聚乙二醇、聚乙二醇的胺衍生物、聚乙二醇的羧酸鹽衍生物、聚丙二醇、聚丙二醇的胺衍生物、聚丙二醇的羧酸鹽衍生物、聚（1，2-亞乙基二醇）酯、聚乙烯亞胺、三甲氨-聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它們的混合物。最佳聚合物是聚乙二醇?？扇苡诤l酵啤酒的任何形式的聚乙二醇都是適宜的。特別有用的是分子量約3350的聚乙二醇。在室溫下它是固態的。在商業生產規模上便于處理。

無機鹽可以是化合物，其中陽離子是鈉、鉀、鎂和銨，陰離子是硫酸根、碳酸根、檸檬酸根、氯根、磷酸根及其它們的混合物。最佳鹽類是氯化鈉和硫酸鈉。