[其他]一種蛋白質氨基末端殘基的有選擇化學去除

無效

• 申請號: 86107569
• 申請日: 1986-10-28
• 公開（公告）號: CN86107569A
• 公開（公告）日: 1987-07-08
• 發明（設計）人: 理查德·丹尼斯·迪馬奇;杰拉爾德·斯蒂芬·布魯克
• 申請（專利權）人: 伊萊利利公司
• 主分類號: C07K7/26
• 分類號: C07K7/26;C07K7/40;C07K15/26
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 王巍

在基因轉換的原核細胞中生物合成蛋白質，得到具有連在氨基末端的一個N-甲酰基-蛋氨酸的蛋白質表達。因為N-甲酰基-蛋氨酸加到天然蛋白質上，可以改變其生物活性，結構穩定性，抗原性等等，所以，若有可能，最好是除去它。

通過在氨基末端蛋氨酸和所要得到的天然肽之間引入一個斷裂位置，從而得到所需要的天然肽產物，這從理論上講，可供選擇的方法是靈活多樣的。但是事實上，要得到有選擇的斷裂的可行方法卻是非常有限的。

例如，對于不含蛋氨酸的那些天然蛋白質，引起產生斷裂（蛋氨酸是選擇的斷裂位置）的溴化氰，已經證明是產生天然蛋白質的有效方法。但是在事實上，在中等大小的肽和蛋白質中，不含蛋氨酸的情況是十分罕見的。因此，一個最重要的任務是去發現一種方法，可以斷開氨基末端的蛋氨酸，制備天然的生物合成的蛋白質。

確定任何從氨基末端蛋氨酰蛋白質產生天然蛋白質的方法的一個關鍵和意想不到的發現是，生物合成的表達產物的α-氨基，例如N^α-蛋氨酰-（人類生長激素），不被甲酰化。這個事實首先是通過用氰酸鹽對表達產物進行化學改造才發現的，后來又為自動埃德曼（Edman）序列分析所證實。雖然不會斷裂起始的蛋氨酸，但是可以假定由于酶的作用，E.Coli表達的有機體卻可有效地去除N^α-甲酰基。因此，氨基末端蛋氨酸表達產物的α-氨基可以（至少是可能）直接用于斷裂。

在氨基末端蛋氨酰表達產物上有一個游離的α-氨基，導致了除去蛋氨酰的其它方法的可能性。一種方法是使用異硫氰酸苯酯進行有選擇的埃德曼型氨基末端順序斷裂，實際應用中要求在天然蛋白質中不含有賴氨酸殘基。但是，只有極少數蛋白質中沒有賴氨酸。

另外可能的方法是用肽鏈端解酶，原則上，這樣能夠分段將氨基酸斷開。但是，由于種種理由，包括它們的非均勻性，價格高昂，對變性作用的敏感性，更為重要的是它們對不同基質的特征的和非特征的作用有很大差別，所以在合成研究中，很少見到成功使用肽鏈端解酶的報道。

已經發現了一種新方法，這種方法代表新的化學方法，同時提供新的化合物，以用于進行有選擇的氨基末端斷裂，從而產生所需的最終肽產物。本發明指的正是這一方法和具有上述用途的化合物。

因此，本發明涉及具有下列結構式的一類化合物。

H-X-脯-肽

此處，X是一種天然存在的氨基酸殘基;肽是指一個有確定生物活性的肽或蛋白質的氨基酸殘基鏈。

本發明提供一種方法，從而可由如下結構式的化合物生產一種具有氨基酸鏈的化合物，該氨基酸鏈表示一種具有生物活性的肽或蛋白質，

H-X-脯-肽

其中，X是一種天然存在的氨基酸殘基，肽是指有確定生物活性的肽或蛋白質的氨基酸鏈。在第一種實施方案中，方法包括使H-X-脯-肽在一種質子惰性溶劑中，經受弱酸條件處理。在第二種實施方案中，H-X-脯-肽在含水緩沖溶液介質中，經受酸性，中性或堿性條件處理。無論在哪一種實施方案中，伴隨斷裂，H-X-脯-部分形成二酮哌嗪，同時釋放出肽。

已經發現的、能提供本發明的物質的方法包括為生產下式化合物設計的生物合成過程，

H-X-脯-肽

其中，X和肽的意義規定如上。化合物能夠用現在通用的重組DNA技術制備，同時能夠作為直接表達產物或作為一種前身表達產物的處理結果而間接得到。

為了得到所需要的，但尚不能用重組DNA方法直接制備的、術語“肽”所特指的化合物，此時化合物H-X-脯-肽是非常有用的。根據本發明的方法處理化合物H-X-脯-肽時，通過形成中間體二酮哌嗪，而得到所需產物（肽）。在質子惰性溶劑中的斷裂過程：通常用下列順序來描述：

如前所述，基團γ是天然存在的氨基酸側鏈。

在H-X-脯-肽中，基團X表示任何天然存在的氨基酸的一個殘基。但是，X代表的氨基酸殘基最好不是脯氨酸，因為脯-脯順序只能很慢地形成斷裂過程所需的二酮哌嗪中間體。最常見的是用重組DNA方法產生H-X-脯-肽。當化合物直接作為表達產物產生時，基團X將是蛋氨酰;因此，本發明所指的X最好是蛋氨酰。但是，當基團X不是蛋氨酰時，化合物的來源也可以是生物合成的。但是，表達產物將首先被一種能產生H-X-脯-肽的方法處理。

這里的“脯”項指的是天然存在的氨基酸脯氨酸的氨基酸殘基。