[其他]直接將DNA插入質(zhì)體和線粒體

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 86107908
• 申請日: 1986-11-21
• 公開（公告）號: CN86107908A
• 公開（公告）日: 1987-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 英格·波特里庫斯;雷蒙德·道格拉斯·希利托;馬麗·戴爾·奇爾頓
• 申請（專利權(quán)）人: 希巴-蓋吉股份公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N5/00
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利代理部
• 代理人: 辛敏忠,顧柏棣

本發(fā)明是一種定向的直接將基因轉(zhuǎn)移到植物細胞原生質(zhì)體中的質(zhì)體或線粒體，特別是葉綠體中的一種方法。對本發(fā)明來說，植物是進行光合作用的單細胞或多細胞的有機體。植物細胞原生質(zhì)體是用纖維素酶部分或全部處理細胞壁物質(zhì)轉(zhuǎn)變而成的植物細胞。

葉綠體成為某些類除草劑的目標，例如三嗪除草劑。近來發(fā)現(xiàn)，阿特拉津（Atrazine），一種三嗪類除草劑，作用于稱為psb????A的葉綠體基因（Hirschberg等，1984）所編碼的32千道爾頓（Kd）的多肽。psb????A的編碼區(qū)中的一個單核苷酸的取代導(dǎo)致在32Kd多肽中的一個氨基酸的取代，從而賦予對阿特拉津的抗性。在雜草中發(fā)生這種突變的有，例如綠穗莧和龍葵。

能直接引進基因到植物，特別是農(nóng)作物的質(zhì)體和線粒體的基因組中去，是人們的宿愿。這樣將能引進新的基因和所期望的特征到所希望的植物中去。例如，賦予除草劑抗性基因，為了在對除草劑敏感的葉綠體中產(chǎn)生除草劑抗性是必要的。

至今，為了得到對在葉綠中具活性的除草劑的抗性或耐性，人們已開始操作植物細胞核的染色體組。但是，這樣一種策略，僅付與對這些除草劑以耐性而不是真正的抗性。還不能通過直接的基因轉(zhuǎn)移使作物具有對葉綠體作用的真正抗性。因此，也不能認為用這種方法能夠轉(zhuǎn)化諸如葉綠體的質(zhì)體。

引進一個具有期望特征的基因，例如除草劑抗性到植物核染色體組的另一個缺點，是由于這種抗性也通過授粉引入了某些雜草。這種雜交將提供將所期望的特征引進雜草中去的機制。

為引進基因到植物細胞核染色體組中去的最普遍的方法是，用致病菌侵染細胞，例如含有Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)的土壤桿菌屬（農(nóng)桿菌屬）（Agribacterium）（Barton等，1983，Chilton等，1985）。

這種方法由于侵染而受到損害。其缺點包括限于宿主的特異性和必須將轉(zhuǎn)化的植物細胞與用于轉(zhuǎn)化程序的病原分開。在環(huán)境中釋放這種病源菌已引起關(guān)注（Roberts，1985）。

De????Block等（1985）報導(dǎo)利用土壤桿菌屬Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)將一個編碼抗生素抗性基因引進能夠再生整個細胞和完整植物的煙草原生質(zhì)體的葉綠體基因組。然而這些研究者發(fā)現(xiàn)在無抗生素存在的情況下，基因是不穩(wěn)定的，并且在很短的時期內(nèi)便消失了。只有在抗生素選擇的情況下，植物才能保持引進的基因，因此沒有實際的應(yīng)用價值。

直接地以缺口線狀或環(huán)狀質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化植物細胞原生質(zhì)體的方法也是眾所周知的（Pasz-Kowski時，1984;Schilperoor等1983）。這種方法無需用病源菌侵染植物細胞，然而到目前為止，這種方限于對核的轉(zhuǎn)化。

為了能夠授與植物細胞有利的新的性質(zhì)，而不用病源菌侵染防止這種性質(zhì)被轉(zhuǎn)移到雜草中去，需要一種允許直接轉(zhuǎn)移有用基因進入質(zhì)體和線粒體基因組的方法。更進一步需要一種能直接將基因穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移到植物細胞的質(zhì)體和線粒體以及整個植株的方法，以使在田間作物生長發(fā)育期間，基因能穩(wěn)定地表達而不致丟失。

因此，本發(fā)明的主要目的，是提供一種直接將基因引進維持在質(zhì)體和線粒體，特別是葉綠體中，而不用病源侵染的方法。本發(fā)明的進一步目標是產(chǎn)生含有遺傳工程組建的質(zhì)體或線粒體，能穩(wěn)定地維持和表達引進性狀的植株。

這個和另一個目標從下面說明中可以看到，由于提供一個將在質(zhì)體或線粒體中含有一個或多個在質(zhì)體或線粒體中具有功能的啟動子的基因的DNA，直接引入植物細胞質(zhì)體或線粒體的程序，這程序包含暴露DNA于在培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體，給予一個充分的時間，讓DNA滲入原生質(zhì)體和原生質(zhì)體中的質(zhì)體或線粒體，而無需將原生質(zhì)體暴露于病源菌。

圖1是概述構(gòu)建質(zhì)粒pCAT°和p32CAT的步驟程序方框圖。

圖2是概述構(gòu)建質(zhì)粒pUCHl的步驟的程序方框圖。

圖3是概述構(gòu)建質(zhì)粒pBRCAT步驟的程序方框圖。

圖例

X＝XhoⅠ

S＝SmaⅠ

H＝HindⅢ

B＝BamHⅠ

RⅠ＝EcokⅠ

Sl＝SalⅠ

LⅠG＝T₄DNA連接酶的連接作用

X/S1指示一個Xhol位點連接在一個SalⅠ位點的一個兩種酶都不能酶切的雜交位點。

CAT表示氯霉素乙酰（基）轉(zhuǎn)移酶的編碼區(qū)。CAT°表明CAT基因無啟動子的形式。

在圖1～3中，psb????A基因用黑色線條指示，

它的啟動子用黑色的框表示。

圖1～3中，CAT編碼區(qū)用點表示。

以下定義適用于發(fā)明申請專利的說明書和權(quán)利要求書;