[其他]改良酵母菌株

在審

• 申請號: 86108803
• 申請日: 1987-04-25
• 公開（公告）號: CN86108803A
• 公開（公告）日: 1988-11-09
• 發明（設計）人: 戴維德·T·羅格斯;托克·W·佐斯塔克
• 申請（專利權）人: 遺傳學研究所公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N1/18
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣

本發明涉及酵母、特別是涉及具有較高二氧化碳和乙醇產生速率的面包或啤酒酵母。例如，較高的二氧化碳釋放速率可使面包酵母更迅速地發酵，而較高的乙醇產生速率則可減少釀造啤酒的時間。本發明還涉及包括經調節去除轉錄阻斷在內的調節基因表達的新方法。

酵母是一種最古老的養殖植物，其使用歷史將追溯到公元前2000年。在許多被認識的酵母種屬中，啤酒酵母最為經濟和特別重要的，它被廣泛地應用于面包制作，釀酒及果酒制造工業以及生物量的生產中（如見Read.G.，“Yeasts”，Kirk????Othmer????Encyclopedia????of????Chemical????Technology，24：711-806，John????Wiley????&????Sons，New????York，1984）。

雖然不是唯一的，但在發酵過程中酵母的功能是所提供的二氧化碳和乙醇的主要來源，為此必須將足夠的酵母、麥芽汁或其它可發酵的底物加入生面內，以獲得所期望的二氧化碳和乙醇生產速率。如果使用一種有較大活性的酵母，即可減少酵母的用量，相應地降低生產成本。

改進酵母的發酵能力是不斷對其進行研究的結果。干酵母和濕酵母均可改良，以提高其二氧化碳產生能力，從而（1）減少發酵時間和/或（2）使用較少的酵母，以降低制作面包及釀酒的成本。改善酵母發酵能力亦可制得更穩定的活性干酵母（ADY）。一般說來，由新鮮酵母培養物制備ADY，發酵能力約丟失40%。為消除或減少這一問題，須進一步研究改進。

改善干酵母活性的手段之一是改進干燥方法，或者改善酵母菌株的干燥性質，從而防止在干燥期間出現活性丟失。業已進行了干燥方法的改良，並將傳統的遺傳學方法用于解決這一問題，且已取得了一定的成功（見美國專利3933783號）。

美國專利4420563號中述及了解決低活性干酵母問題的另一途徑。其改善酵母特別是高糖含量甜面團中酵母之發酵活性的方法是，在酵母的后期增殖階段向生長的酵母培養物內加鹽，從而誘導酵母發酵活性的提高。

本發明則是通過遺傳學和化學誘導進行修變（modification），以提高酵母菌株的二氧化碳和乙醇的產生活性。

本文公開了增加由酵母產生二氧化碳、乙酵和其它發酵產物（如檸檬酸）之速率的方法。一般說來，該方法包括降低酵母細胞中的ATP含量，以達到刺激糖酵解的目的。本發明的一個方面是，通過在酵母基因型中（如通過單拷貝或多拷貝載體，或通過共整合作用進入酵母基因組內）用一可調節的啟動子置換編碼代謝酶之基因的天然啟動子，使酶得以可調節的表達，進而允許由該酶催化的代謝反應在逆反應的同時進行，以使ATP被消耗。本發明的另一個方面是，這種修變也包括了將一編碼代謝酶的基因插入酵母基因型內，經如此處理后即使得基因的表達處于啟動子的表達控制之下，從而允許由該酶催化的代謝反應能在逆反應的同時進行，進而消耗ATP。此外，本發明的修變還包括修變編碼代謝酶的基因，從而阻止或消除變構或其它抑制作用，或阻止與消除對酶的失活化作用。

在一實施方案中，其所涉及的酶是FDP酶。該FDP酶的基因可被另加誘變，以除絲氨酸外的其它氨基酸的密碼子置換酶的絲氨酸-12的密碼子;或加入某些化學物質（如AMP或/和果糖-2，6-二磷酸）以降低或消除對酶的變構抑制作用。在本發明的另一實施方案中，這種遺傳修變包括了修變細胞外AP酶基因，如通過除去基因的編碼前導序列的部分，使被修變的酶保留在酵母胞漿內並催化細胞內的ATP水解。

本發明所提供的一個有利條件在于，遺傳修變過程只能在發酵期間尤其是在發酵的早期階段，而不是在酵母生產水平的生長階段被“打開”。這對于制作面包所使用的酵母是一個很重要的有利條件。另外，通過這種遺傳修變可導致酵母的組成表達，使之能在大規模生產期間即酵母的商業規模培養期間被打開，從而得以提高發酵產物如乙醇的產生速率。

對遺傳修變的調節可由一溫度敏感性啟動子或由某特殊化學物質誘導的啟動子來完成，以使酶只能在預定的溫度下或者只能在有該物質存在的條件下方可得以表達?；蛘?，表達控制亦可通過將-FLP基因構建物插入酵母基因組內來達到-對此，將在下文中詳細闡述。

用于這些方法的載體包括單拷貝、含有著絲粒的質粒和含有酵母2μ復制原點的多拷貝質粒，以及允許共整合進入酵母基因組的載體。

本發明進一步包括的方法是，通過培養酵母或使酵母與可直接或間接引起ATP消耗的化學物質相接觸以降低ATP水平。這樣的化學物質包括相對小的有機分子以及如酵母殺傷毒素等蛋白質。

最后，本發明還包括了用本文所公開之方法遺傳修變的酵母菌。