[其他]赤豆葉肉原生質體分離培養與綠苗分化技術

無效

• 申請號: 87101002
• 申請日: 1987-03-25
• 公開（公告）號: CN87101002A
• 公開（公告）日: 1988-03-30
• 發明（設計）人: 葛扣麟;王韞珠;袁勛梅;黃培銘;楊金水;聶志平
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 復旦大學專利事務所
• 代理人: 華以正,陸飛

本發明是赤豆（Phaseolus????angularis）葉肉原生質體的分離制備、培養、愈傷組織誘導、擴增及綠苗分化的整套方法。本發明適用于豆科植物菜豆屬赤豆（Phaseolus????angularis????Wight）葉肉原生質體分離，培養與綠苗分化。

豆科植物的原生質體培養是具重要經濟價值的豆類作物遺傳操作的重要手段，它在植物基因工程遺傳轉化受體系統方面的應用，以及在細胞融合，體細胞變異的選擇利用等研究方面已顯示出巨大潛力。但據1986年報導，豆科植物從原生質體再生植株僅限于苜蓿、車軸草、胡蘆巴等少數種類。至于籽粒用豆科植物原生質體培養成苗的研究工作至今未見報道。本發明在赤豆原生質體分離、培養、愈傷組織形成及綠苗分化上的成功，是籽粒用豆科植物原生質體培養的一個突破。

從赤豆葉肉原生質體培養至綠苗分化的過程中，對于被酶解后分離出來的原生質體進行培養是關鍵的一環。本發明在原生質體培養基中采用0.5-0.65M濃度的葡萄糖作為碳源和滲透壓穩定劑。

眾所周知，試驗材料的生理狀況是影響豆科植物原生質體培養能否取得成功的重要因素。本發明采用接種11-16天的赤豆無菌苗真葉為游離原生質體材料，具有取材方便，材料生長旺盛等特點。本發明采用的酶解液成份是與含量是：CaCl₂·2H₂O，1480.0mg/L;KH₂PO₄，27.2mg/L;KNO₃，101.0mg/L;MgSO₄·7H₂O，246mg/L;CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L;KI，0.16mg/L;Mannitol，130g/L，并在其中加入0.5%-1%（W/V）的纖維素酶和0.5%-1%（W/V）的半纖維素酶，該混合酶液經12-16小時，在25℃-27℃的溫度條件下振蕩酶解。酶解完成后用400目鎳絲網過濾酶解液，可得產率高，活力強的原生質體。

本發明提出一種適合于赤豆葉肉原生質體培養的基本培養基成份。其中無機鹽成份中含有600-1000mg/L的CaCl₂·2H₂O，1200-1500mg/L的KNO₃，200-300mg/L的NH₄NO₃，60-90mg/L的KH₂PO₄，600-900mg/L的MgSO₄。與常用的MS培養基（見Murashige，T.and Skoog，F.，1962，Physiol.Plant，15：473-497.）相應的成份與用量相比，本發明的培養基的無機氮源含量低，KH₂PO₄含量亦較低，但MgSO₄·7H₂O含量明顯增加。基本培養基的維生素成份中含有0.02-0.08mg/L生物素，0.1-0.8mg/L葉酸，100-200mg/L的肌醇，3.0-3.5mg/L的鹽酸硫胺素，0.5-0.8mg/L的鹽酸吡哆素，1.0-2.0mg/L的甘氨酸，3.0-4.0mg/L的煙酸。與上述MS培養基相比，除甘氨酸以外，各種維生素含量都有了提高，而且增加了生物素與葉酸二類物質。試驗結果表明，使用增加維生素，增加鎂離子含量，降低無機氮源濃度的培養基成份，原生質體植板率可以達到5.5%。

本發明以0.5-0.65M葡萄糖作為唯一碳源和滲透壓穩定劑。這一條件最適合赤豆原生質體的生長，分裂和愈傷組織形成。采用不同糖的種類，并改變各種糖的使用濃度，試驗結果差別很大，其中以葡萄糖作為唯一的碳源和滲透壓穩定劑最適合赤豆原生質體的生長和分裂。不同濃度的葡萄糖也影響到試驗結果，采用0.5-0.65M濃度的葡萄糖時，原生質體再生細胞的生長狀態正常、分裂也旺盛。低于0.5M時，生長狀態明顯下降，植板率為0;而高于0.65M濃度時，再生細胞就極少分裂或不分裂。若以蔗糖作碳源，甘露醇作滲透壓穩定劑，同樣是0.5-0.6M濃度的糖，再生細胞的生長狀態均見下降，前者未見分裂，后者極少分裂。因此從試驗結果可以看出，蔗糖或是甘露醇對于赤豆葉肉原生質體的生長和分裂似有某種程度的抑制作用。