[其他]改良產(chǎn)抗菌素微生物的新方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 87102137
• 申請(qǐng)日: 1987-03-20
• 公開（公告）號(hào): CN87102137A
• 公開（公告）日: 1987-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 卡倫·利·考克斯;斯科特·埃里克·菲什曼;查爾斯·李·赫什伯格;尤金·托馬斯·塞諾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 伊萊利利公司
• 主分類號(hào): C12N15/00
• 分類號(hào): C12N15/00;A61K31/70
• 代理公司: 中國(guó)專利代理有限公司
• 代理人: 林玉貞,曹恒興

本發(fā)明提供了一種提高產(chǎn)抗菌素微生物之產(chǎn)生抗菌素能力的新方法。該方法包括用于表達(dá)基因產(chǎn)物的DNA編碼序列轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞-其中基因產(chǎn)物在所需的抗菌素生物合成途徑中起限速作用。本發(fā)明還提供了編碼抗菌素生物合成基因產(chǎn)物的相關(guān)DNA序列、重組DNA表達(dá)載體以及轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。

本發(fā)明代表了重組DNA技術(shù)在產(chǎn)抗菌素微生物如鏈霉屬微生物中的早期的并且是很重要的商業(yè)化利用。在本發(fā)明之前，對(duì)重組DNA技術(shù)的開發(fā)和利用大部分是局限在大腸桿菌及哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)特定的多肽。這些進(jìn)展使我們可以比較簡(jiǎn)單地表達(dá)異源基因產(chǎn)物，如人胰島素A和B鏈、人胰島素原、人生長(zhǎng)激素、人反應(yīng)蛋白C、人組織血纖維蛋白溶酶原激活因子、牛生長(zhǎng)激素及其它幾種有潛在應(yīng)用價(jià)值之化合物。在上述各情況中，異源基因的表達(dá)或多或少都是獨(dú)立的，并且沒有作用于或參與或調(diào)節(jié)每個(gè)起作用的生物合成途徑?，F(xiàn)在，重組DNA技術(shù)已能夠用于改善選擇的生物合成途徑，以提高抗生素或抗微生物前體的表達(dá)產(chǎn)率。

應(yīng)用于鏈霉菌屬及其它產(chǎn)抗菌素微生物的大多數(shù)重組DNA技術(shù)僅是限于對(duì)克隆載體的研究開發(fā)。早期的嘗試包括有Reusser在美國(guó)專利4332898號(hào)中以及Manis等人在美國(guó)專利4273875號(hào)4332900號(hào)、4338400號(hào)和4340674號(hào)所公開的方法。在這些較早的文獻(xiàn)中并沒有公開過有關(guān)對(duì)鏈霉屬的轉(zhuǎn)化技術(shù)。但曾公開了產(chǎn)抗生素微生物中有較大應(yīng)用潛力的改良載體，如Fayerman等人在美國(guó)專利4513086號(hào)中、Nakatsukasa等人在美國(guó)專利4513085號(hào)和4416994號(hào)中公開的載體。這些改良的載體包含有在鏈霉菌中可選擇的標(biāo)志、能夠用于轉(zhuǎn)化許多重要的鏈霉屬菌株，并可構(gòu)建進(jìn)行更為復(fù)雜的基因克隆實(shí)驗(yàn)所需要的工具。

最近由Hopwood等人（Nature，314∶642，1985）報(bào)導(dǎo)了一項(xiàng)這樣的實(shí)驗(yàn)。雖然Hopwood等人報(bào)導(dǎo)了有關(guān)新的雜合抗菌素色素的生產(chǎn)，但除了描述自鏈霉屬菌株向其它菌株轉(zhuǎn)移放線菌紫素色素生物合成基因外，并沒有涉及增加一定的宿主細(xì)胞產(chǎn)抗菌素能力或生物合成效率的內(nèi)容。

本發(fā)明之所以特別有用，是因?yàn)樗蓪⒅亟MDNA技術(shù)在商業(yè)上應(yīng)用于鏈霉菌及其它產(chǎn)抗菌素的微生物。又因?yàn)榕R床上重要的抗菌素有一半以上是由鏈霉菌產(chǎn)生的，故特別期望開發(fā)可應(yīng)用于這些微生物的方法。本發(fā)明提供了這類方法，使之可以克隆增加抗生素生產(chǎn)能力的基因以及能在產(chǎn)抗菌素微生物中生產(chǎn)新抗菌素及抗菌素前體的基因。

為使本發(fā)明公開清楚起見，茲對(duì)有關(guān)術(shù)語(yǔ)定義如下：

抗菌素-由某種微生物產(chǎn)生的物質(zhì)（可以是天然的產(chǎn)物或經(jīng)過有限化學(xué)修飾的），可抑制或阻止其它微生物或真核細(xì)胞生長(zhǎng)，或殺死其它微生物或真核細(xì)胞。

抗菌素生物合成基因-編碼某種酶活性的基因或編碼某種可調(diào)節(jié)酶活性之表達(dá)產(chǎn)物的DNA片段。這種酶活性對(duì)于將初級(jí)代謝物轉(zhuǎn)化為抗菌素中間體的酶促反應(yīng)是必需的。這些抗菌素中間體亦可能具有抗菌素活性，且也許繼后轉(zhuǎn)變成抗菌素。

抗菌素生物合成途徑-為初級(jí)代謝物轉(zhuǎn)變?yōu)榭咕刂虚g體，并于其后再轉(zhuǎn)變?yōu)榭咕厮匦璧囊惶淄暾目咕厣锖铣苫蚣吧?!-- SIPO -->物化學(xué)反應(yīng)。

產(chǎn)抗菌素微生物-可以是任何微生物，但其中不只限于游運(yùn)放線菌屬Actinoplanes、雙岐放線菌屬Actinomadura、芽孢桿菌屬Bacillus、頭孢菌屬Cephalosporium、小單孢菌屬M(fèi)icromonospora、青霉屬Penicillium、諾卡氏菌屬No-cardia和鏈霉菌屬Streptomyces，其可產(chǎn)生某種抗菌素或含有編碼某種抗菌素產(chǎn)物的基因，如經(jīng)表達(dá)，即可產(chǎn)生某種抗菌素。

抗菌素抗性基因-一個(gè)DNA片段，能編碼使微生物對(duì)某種抗菌素能有抗性的活性。

ApR-氨芐青霉素抗性表型或使微生物產(chǎn)生這種抗性的基因。

宿主細(xì)胞-包含有能用某種重組DNA克隆載體轉(zhuǎn)化的活原生質(zhì)體的微生物。

NmR-新霉素抗性表型或使微生物產(chǎn)生這種抗性的基因。

抗菌素生物合成途徑的運(yùn)轉(zhuǎn)-抗菌素生物合成基因的表達(dá)及能使初級(jí)代謝物轉(zhuǎn)變?yōu)榭咕厮枰挠嘘P(guān)生物化學(xué)反應(yīng)。

重組DNA克隆載體-任何可選擇的并獨(dú)立復(fù)制的因素或在染色體上整合的因素，包括質(zhì)粒和噬菌體，但不限于它們。這種DNA載體分子可加入或已加入了附加的DNA。

rep-附圖中所用的符號(hào)，為鏈霉屬質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)。

限制性酶切片段-任何經(jīng)一種或多種限制性內(nèi)切酶的作用所產(chǎn)生的線性DNA。