[其他]白細(xì)胞三烯A4水解酶放射免疫測定藥盒及制備工藝

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 87102689
• 申請(qǐng)日: 1987-05-14
• 公開（公告）號(hào): CN87102689A
• 公開（公告）日: 1988-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 富繼義;歐羅夫·洛德馬克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 白求恩醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/14
• 分類號(hào): C12N9/14;G01N33/534
• 代理公司: 吉林省專利服務(wù)中心
• 代理人: 劉玉璠

本發(fā)明屬生物化學(xué)領(lǐng)域。

白細(xì)胞三烯A₄在白細(xì)胞三烯A₄水解酶（LTA₄H）作用下，產(chǎn)生白細(xì)胞三烯B₄。白細(xì)胞三烯B₄是一種重要的生物活性物質(zhì)，是炎癥反應(yīng)和過敏反應(yīng)中白細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的最有效的激活劑。因而，微量測定白細(xì)胞三烯B₄體內(nèi)合成的維一通路-LTA₄H，這對(duì)于研究人體免疫功能有重要意義。

以往測定LTA₄H，使用LTA₄H活性檢測法。由于活性檢測靈敏性較低，效果不夠理想，放射免疫測定方法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏性高，特異性強(qiáng)，是測定LTA₄H的理想方法。

目前，國內(nèi)外尚無LTA₄H放射免疫測定藥盒及其制備方法，本發(fā)明的目的是建立LTA4H的放射免疫測定藥盒的制備方法，提供特異性強(qiáng)，靈敏，可靠的藥盒。

本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是首先由人全血中提取白細(xì)胞，再由白細(xì)胞提純LTA₄H;制備抗LTA₄H抗血清;用¹²⁵I標(biāo)記LTA₄H;進(jìn)行¹²⁵I-LTA₄H的純化，最后建立放射免疫測定方法，制成可供科研使用的藥盒。

實(shí)施方案：

一、由人全血中提取白細(xì)胞：

首先將已加入抗凝劑的全血離心，取白細(xì)胞粗提液，置于量筒內(nèi)，加一倍體積的白細(xì)胞懸浮液，混合后，自然沉淀10-20分鐘，將上清液吸出，離心。取沉渣，為多核白細(xì)胞。為保證白細(xì)胞的純度，在離心管中加紅細(xì)胞溶解液20mL左右，再離心取沉渣為白細(xì)胞。放4℃冰箱備用。

二、由白細(xì)胞中提取LTA₄H：

（1）將白細(xì)胞制成勻漿，離心，去殘?jiān)?/p>

（2）加硫酸鏈霉素輕攪拌，離心，除去核酸類物質(zhì)，留取上清。

（3）用硫酸銨分段鹽析法，留取鹽飽和度40-80%的蛋白質(zhì)沉淀

（4）透析除去樣品中的硫酸銨。

（5）二乙基氨乙基（DEAE）纖維素離子交換層析，用活化后的DEAE纖維素制成層析柱，用高鹽緩沖液做梯度洗脫。

圖1是DEAE-纖維素離子交換層析蛋白質(zhì)分離圖，〔1〕為留取樣品部分。被收集樣品用超濾器濃縮。

（6）ACA-44凝膠過濾層析。圖2是ACA-44凝膠過濾層析的蛋白質(zhì)分離圖。〔1〕為留取樣品部分收集于管內(nèi)，用超濾器濃縮。

（7）高壓液相離子交換層析，MOnO????Q層析柱用高鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。圖3為高壓液相MOnO????Q離子交換層析的蛋白質(zhì)分離圖。〔1〕為留取樣品部分，收集于管內(nèi)、用葡聚糖凝膠過濾柱層析脫鹽

（8）高壓液相羥基磷灰石柱層析。用高鹽緩沖液做梯度洗脫，圖4為高壓液相羥基磷灰石柱層析的蛋白質(zhì)分離圖。〔1〕為留取樣品部分。

至此LTA₄H提純完成。

三、LTA₄H抗血清的制備：

（1）純化的LTA₄H使用十二烷基磺酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳再純化。取LTA₄H加4倍樣品緩沖液，分10份、加入樣品膠的樣品井內(nèi)，電泳3-4小時(shí)，取下凝膠染色。然后進(jìn)行脫色，顯示LTA₄H在凝膠上的位置，準(zhǔn)確裁割下來。將凝膠與完全福氏佐劑混合，制成勻漿，備用。

（2）用LTA₄H免疫家兔。給家兔肌注LTA₄H勻漿。2周后，用同樣方法加強(qiáng)免疫一次。4周后加強(qiáng)免疫一次，4周后再加強(qiáng)免疫一次。一周后取兔全部血液，凝固后，離心，獲得血清。

四、LTA₄H的¹²⁵I標(biāo)記：

取1-2毫居Na〔¹²⁵I〕，加入5-15微克LTA₄H，然后加入氯銨-T，開始碘化反應(yīng)。充分混合，3-5分鐘后加入Na₂S₂O₅

終止碘化反應(yīng)。加入碘化鉀和0.1%牛血清白蛋白保護(hù)碘化蛋白質(zhì)。使用葡聚糖凝膠柱，分離末與LTA₄H結(jié)合的游離¹²⁵I。

五、¹²⁵I-LTA₄H的純化：