[其他]純化的胎兒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 87105215
• 申請日: 1987-07-30
• 公開（公告）號: CN87105215A
• 公開（公告）日: 1988-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彼里·尼科拉斯·約安
• 申請（專利權(quán)）人: 法國德巴實驗室公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;A61K37/52;A61K39/395;G01N22/577
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣,李瑛

本發(fā)明以一種新的工業(yè)產(chǎn)品的形式涉及純化的胎兒類型的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶，還涉及到制備此產(chǎn)品的方法，尤其是純化該產(chǎn)品的方法。該產(chǎn)品可應(yīng)用于（?。┒糠治?，尤其是含有抗原-抗體反應(yīng)的免疫學分析;（ⅱ）制備用作藥物的抗體。

胸腺嘧啶脫氧核苷激酶（TK），負責胸腺嘧啶脫氧核苷磷酸化為5′-單磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷（d-TMP），在DNA合成并從而在細胞再生過程中起重要作用。在處于增殖和再生的組織中以及被病毒感染的細胞中TK活力高。在真核細胞中檢測到TK的兩種同功酶：胎兒類型的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶（此后稱為“胎兒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶”或TK-F）和成熟型胸腺嘧啶脫氧核苷激酶（此后稱為“成熟胸腺嘧啶脫氧核苷激酶”或TK-A）。

TK-F出現(xiàn)于胚性組織，并在依賴于激素的癌癥的癌性組織，尤其是乳腺癌和前列腺癌中被檢測到，參見J.L.Javre′et????al.in????Bull.Cancer（Paris）73（No.1），第8-16頁（1986），題目是“Mise????en????evidence????de????la????thymidine????kinase????de????type????foetal????dans????les????cancers????du????sein”（即：乳腺癌中胎兒型胸腺嘧啶脫氧核苷激酶的檢測）和J.L.Javre′????et????al.的文章，已投送Cancer????Research待發(fā)表，題目“胎兒型胸腺嘧啶脫氧核苷激酶在人類乳腺癌中的存在”。

還已知各種性激素在它們的靶器官，即前列腺和子宮中大大激增體內(nèi)TK-F的合成;參見M.Bourtourault????et????al，in????J.Steroid????Biochem.，21（No.5），第613-620頁（1984），題目“大鼠子宮中17β-雌二醇對胸腺嘧啶脫氧核苷激酶活力的刺激?！币约癎.Gayet????et????al.in????The????Prostate????Ⅰ，第261-270頁（1985），題目“大鼠前列腺中雄性激素誘導胎兒胸腺嘧啶脫氧核苷激酶。

TK-F從TK-A的分離采用電泳或陰離子交換樹脂層析方法，例如丙烯酰胺凝膠電泳，或更傾向于采用DEAE-纖維素凝膠或DEAE-葡聚糖凝膠層析，上述凝膠由Pharmacia公司出售，胎兒型同功酶具有零或低遷移率，成熟型同功酶則遷移很快。

以這種方式分離的TK-F所具有的酶活力為每毫克2國際單位，不適于（ⅰ）進行更為準確的定量分析，尤其不適于（ⅱ）制備多克隆特別是單克隆抗TK-F抗體，后者用于診斷和治療領(lǐng)域。

根據(jù)本發(fā)明第一個特點，以一種新的工業(yè)產(chǎn)品形式，提出一種純化的TK-F，它比到目前為止文獻所用方法分離得到的TK-F具有顯著大的酶活力。

診斷特別需要純化的TK-F，事實上，TK-F活力隨癌癥的類型而變。正如TK-F活力在處于Go期的細胞中很低，而在處于S期細胞中很高，有充分理由相信顯示低TK-F活力的癌癥處于靜止狀態(tài)，而顯示高的TK-F活力的癌癥處于增生狀態(tài)。定量分析乳腺癌和前列腺癌中的TK-F對于確定癌癥增生狀態(tài)具有重要意義。此外，用抗純化的TK-F的抗體定量分析TK-F成為估計癌變發(fā)展并確定治療方向的一個因素。

根據(jù)本發(fā)明的第二個特點，推薦一種制備所述純化的TK-F的方法，該方法包括將需純化的TK-F與胸腺嘧啶脫氧核苷偶聯(lián)，然后切開所得到的復合物（胸腺嘧啶脫氧核苷TK-F）以收集純化的TK-F。

根據(jù)本發(fā)明的另一特點，推薦該純化的TK-F應(yīng)用于制備抗-TK-F抗體，這些抗體將用于診斷和治療。出乎意料的是，確實發(fā)現(xiàn)將抗-TK-F抗體給患有激素依賴性癌癥（特別是乳腺癌如前列腺癌）的病人服用，具有有益的治療效果。

據(jù)本發(fā)明，以一種新的工業(yè)產(chǎn)品形式，推薦一種他人迄今尚未得到的純化的TK-F，可用于定量分析和制備抗TK-F抗體，該純化的TK-F具有酶比活力每毫克大于或等于5000單位，優(yōu)選大于或等于8000單位，最佳為大于或等于10，000單位。

具有酶比活力11，800單位/毫克的純化的TK-F，在非變性介質(zhì)（例如下面所述A和B緩沖液）中電泳的Rf值（pH約8.6）為0.15。

按常規(guī)酶比活力表達為每毫克蛋白的酶單位。所謂TK-F的國際單位是每分鐘每毫克蛋白合成1毫微摩爾核苷酸。換言之，酶活力可表達為nmol/mg蛋白/分鐘。（nmol/mg????of????protein/min）