[其他]采用雜交測定人體T細胞白血病病毒I和II

無效

• 申請號: 87108073
• 申請日: 1987-11-25
• 公開（公告）號: CN87108073A
• 公開（公告）日: 1988-06-08
• 發明（設計）人: 約翰·約瑟夫·史寧史凱;雪利·依·瓦克;伯納德·波意茲
• 申請（專利權）人: 塞特斯公司;紐約州立大學研究基金會
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C12Q1/68;C12N15/00
• 代理公司: 上海專利事務所
• 代理人: 全永留

本發明涉及一種測定病毒中的核苷酸順序是否存在的方法，該病毒涉及人體T細胞白血病病毒Ⅰ型和Ⅱ型（HTLVⅠ和Ⅱ）。本發明還涉及一種用于在引物和標記的雜交探針存在下的這樣測定的裝置。

人們已知道，某些T細胞腫瘤的發病機理中涉及到一族T細胞熱帶還原病毒，稱為人體T細胞白血病病毒（HTLV）。目前，已知道有三種類型的HTLV。第一，Ⅰ型（HTLVⅠ）是一種腫瘤病毒，它和在日本、加勒比海地區和非洲所發現的人類成年人T細胞白血病淋巴細胞瘤（ATLL）有密切的聯系。第二，Ⅱ型（HTLVⅡ）是一種腫瘤病毒，它是從具有毛發狀細胞白血病的T細胞變株的兩個病人中分離出來的。參見M.Popovic等，《Science》224卷497～500頁（1984）和Rosenblatt，J.D等，New????Eng.J.of????Med.，8月號（1986）。第三，Ⅲ型（HTLVⅢ）是一種慢病毒，是一種引起艾滋病（AIDS）的病原體，艾滋病是一種會傳染的細胞免疫系統的疾病，會引起常是致命的感染。

用對付HTLV相關病毒，如艾滋病的抗體鑒定血清的免疫診斷試驗（參見美國專利第4，520，113號，Gallo等）正在血庫中被用于排除潛在感染的血液。也可參見WO86/01834，1986年3月27日公布（加利福尼亞大學），它是用在制備單克隆抗體中有用的還原病毒多肽去測定HTLV族中的還原病毒。因為這種病毒屬于一種不產生有效數量病毒顆粒的DNA復制品，一種測定HTLVⅠ和Ⅱ型有關的病毒的直接免疫方法用于很大部分的無征狀個體持久感染被證明是不成功的。因為在感染組織和血液中病毒顆粒的數量可能是很少的（因為病毒的休眠），病毒顆粒或RNA/DNA的直接測定可能是相當困難的，如果不是辦不到的話，不要把感染細胞與合適的T細胞系進行共同培養。

美國專利第4，683，202號（1987年7月28日公布）中，K.Mullis描述了一種通過采用一種標記的RNA或DNA雜交探針放大核酸順序以促進測定的方法。在這個方法中，引物被用于得到引物延長產物，該延長產物用作核苷酸存在下合成附加的互補鏈的模板。該專利申請案中也描述了一種技術，即：在探針被雜交至所需要的順序上以后，再加上一種限制性內切酶以使在所需要的順序內的某一位置上裂解雜化物，然后對限制性消化進行分析以了解標記片斷。美國專利第4，683，194（1987年7月28日公布），以及《生物技術》第3卷1008～1012頁（1985）中H.Erlich等和Saiki等寫的文章中，更詳細地描述了這一后種技術。兩個專利申請案中都列舉了測定遺傳病，如鐮狀細胞貪血和β-地中海貪血癥的方法的應用。這些方法和用于擴增核酸順序的方法在《Science》第230卷。1350～1354頁（1985）中，Saiki等著的文章中也揭示過。

《Clin.Lab.Med》（1985）第五期。513～529頁上Landry等寫的綜述文章中描述了核酸雜交領域用于病毒測定。WO86/01535（1986年3月13日公告）和歐洲專利173，529號（1986年3月5日公告）中都揭示3HTLVⅢ的分子的克隆和利用克隆作為探針測定艾滋病。更進一步地，歐洲專利公告173，339號（1986年3月5日公告）中，揭示了用DNA探針測定被外來微生物感染的遺傳分析。歐洲專利185，444號（1986年6月25日公告）中，揭示了一種重組肽作為探針用于測定細胞溶解產物中的HTLVⅢ病毒。翁蘇公司（Qncor????Inc.）在1986年9月宣布它發展了一種放射血液試驗測定艾滋病毒。

用于測定腫瘤病毒HTLVⅠ和Ⅱ的雜交探針可能鑒定被持久感染，但不產生病毒的那些個人，也可能鑒定抗體陰性，但培養物陽性的個人，而且測定感染的細胞不需要培養病毒。用擴增法增加病毒的核酸的復制數將有利于鑒定在被感染個體中病毒的核酸。

本發明包括一種測定或檢驗核酸順序是否存在的方法，所述核酸順序是指大量存在于HTLVⅠ或HTLVⅡ核酸的分離體中，或大量存在于HTLVⅠ和HTLVⅡ核酸兩者的分離體中，這種方法對于測定HTLVⅠ或HTLVⅡ的核酸或HTLV和HTLVⅡ兩者分離體中的核酸是特別有效的，該方法包括：

（a）.用核酸順序的每條鏈的寡核苷酸引物、四種不同的核苷三磷酸和一種聚合作用劑在雜交條件下，一起或分別處理樣品，對核苷順序的每條鏈，合成每個引物的延長物，它是與每條核酸鏈互補的，其中所說的引物基本上與待測定或檢驗的核酸順序的每一鏈互補，以每一個引物合成的延長物，當它從它的補體中分離時，可作為其他引物的延長產物合成的模板;