[其他]與結合蛋白相融合的蛋白質的生產及純化

無效

• 申請號: 88101209
• 申請日: 1988-03-10
• 公開（公告）號: CN88101209A
• 公開（公告）日: 1988-12-21
• 發明（設計）人: 灌珠迪;井上弘
• 申請（專利權）人: 新英格蘭生物實驗室公司;坦普爾大學
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P21/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊九昌

本發明涉及利用DNA重組技術生產和/或純化幾乎所有的雜交多肽或融合的蛋白質分子的方法。更具體地說，編碼一種蛋白質分子（如一種多肽或其一部分）的DNA片段與編碼一種結合蛋白的DNA片段（例如編碼麥芽糖結合蛋白的基因）相融合。將融合的DNA插入一個克隆載體中，以此轉化一種合適的宿主。表達以后，產生一種雜交多肽或融合的蛋白質分子，可通過使雜交多肽與結合蛋白對其具有專一親和性的配體或底物接觸而進行純化，例如通過親和層析純化。在某些情況下，這樣純化的雜交多肽可以其雜交形式使用，或也可以進行切割以得到蛋白質分子本身，例如，將編碼蛋白質分子和結合蛋白的DNA片段與編碼一種肽的DNA片段相連接，這種肽能由一種蛋白水解酶識別和切割。本發明還涉及用以實施上述方法的某些載體，以及生物反應器和利用結合的雜交多肽的方法，例如使結合的融合多肽與一種底物接觸并反應，該底物能與結合的蛋白質分子相互作用產生預期的效果。

近來發展的技術已能夠利用能迅速而大量生長的微生物來合成商業上有用的蛋白質和肽。利用這些技術，能夠使一種合適的微生物具有合成通常由其他生物生產的蛋白質或肽的能力。簡言之，使編碼蛋白質的DNA片段連接到克隆載體如質粒中。用克隆載體轉化合適的宿主，鑒定、分離和培養轉化宿主，以啟動所需蛋白質的表達。然后從培養基中分離如此產生的蛋白質并進行純化。

已有多種純化技術被用來收集由DNA重組技術產生的蛋白質。這些技術通常包括根據分子的不同性質分離所需蛋白質，例如，通過透析、密度梯度離心和液相柱層析法分離。這些技術沒有普遍的適用性，并通常要消耗比待純化的蛋白質貴重得多的純化物質，在需要大量高度純化的蛋白質時更是如此。

根據蛋白質的溶解度特性，發展了其他一些方法以純化蛋白質。例如，業已采用等電點沉淀純化蛋白質，因為蛋白質的溶解度作為pH的函數而變化。同樣，蛋白質的溶劑分級分離技術是基于蛋白質的溶解度作為基質介電常數的函數而變化。溶劑分級分離法雖然產率不錯，但通常導致蛋白質分子的變性。等電沉淀和溶劑分級分離都不能用來制取高度純化的蛋白質。這些技術一般都是與其他方法結合使用。

亦已根據離子性質分離蛋白質，例如利用電泳、離子交換層析等。但這些電泳技術一直是作為分析手段使用的，不適于作為大規模純化蛋白質的方法。而且，在這種技術中，很難通過單個步驟就得到高度純化的高產率蛋白質。

親和層析也被用來純化生物聚合物如蛋白質。親和層析涉及一種選擇性吸附劑，使它與含有幾種物質（包括待純化的所需分子在內）的溶液接觸。例如，當用于蛋白質純化時，親和層析一般使用一種與待純化的蛋白質專一結合的配體。一般使配體偶聯或連接于載體或基質上，再使偶聯配體與含有雜蛋白的溶液接觸。通過洗滌除去未結合的分子，通過用專一性解吸附劑進行洗脫回收所需蛋白質。親和層析雖然能產生較高水平的純化蛋白，但此技術需要大量專一于蛋白的配體用于純化。而且，每一種待純化的蛋白質需要不同的配體，這必然使得純化過程既耗時又費力。此外，還發現并不是對于所有類型的蛋白質分子（例如某些酶類）都存在有專一性配體。其結果是，親和層析法并未被成功地用作普遍適用的蛋白質分子的分離純化技術。

0，150，126號歐洲專利申請（Hopp）描述了一種使親和層析普遍適用于所有蛋白質的方法。公開了制備通過DNA重組技術使基因融合而產生的雜交分子的方法。一個基因編碼待純化的所需蛋白，而另一個基因則編碼一個鑒別或標記肽。標記肽含有一個具有高度抗原性的N-末端部分（以此制備抗體），以及一個使標記肽和待純化蛋白質連接的連接部分。利用專一性的蛋白水解劑，可將標記肽的連接部分在鄰接待純化蛋白質的專一氨基酸殘基處切斷。用專一于標記肽中抗原部分的固定化抗體建立親和柱，分離融合或雜交的蛋白質。抗體與融合蛋白質結合，然后，后者可用解吸附劑從柱中釋放。然后，利用蛋白水解劑可將標記肽從所需的蛋白質分子上切下。

Hopp的方法雖然試圖克服上述蛋白純化方法中的某些問題，但該方法需要大量專一于標記肽抗原部分的抗體。而且，釋放靶蛋白所需的解吸附劑（在該例中是一種小肽）的量很大，也是耗費很大的一個因素。另外，還必須從靶蛋白中通過純化去掉解吸附劑。因此，使此系統擴大規模不是切實可行的。進一步，層析柱的再生可能極為困難，因為使用后洗滌柱子所用的條件是不穩定的，它實際上會破壞層析柱。另外有人提議使用低親和性的抗體柱。然而，低親和柱常導致非專一性結合，這對于任何大規模純化來說都需要大量費用。