[其他]一種除去百日咳內毒素的方法，一種百日咳類毒素及生產方法

無效

• 申請號: 88103075
• 申請日: 1988-05-23
• 公開（公告）號: CN88103075A
• 公開（公告）日: 1988-12-21
• 發明（設計）人: 藤田勛;渡邊秀夫;宮本正敏
• 申請（專利權）人: 武田藥品工業株式會社
• 主分類號: C07K15/04
• 分類號: C07K15/04;A61K39/10
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 李瑛

本發明涉及一種除去百日咳內毒素的方法、一種百日咳類毒素及其生產方法。

百日咳是一種由百日咳博德特氏菌（Bordetella????pertussis）引起的傳染性疾病，其可在患兒體內造成嚴重的病理過程。

已經使用疫苗來預防這種疾病，但使用任何一種由百日咳博德特氏菌整個菌體生產的疫苗時，都會出現發燒等強烈的不良反應，為了克服這一缺點，目前已通過分離細菌的抗感染部分（下文中亦稱之為保護部分）-如菌絲血凝素（FHA）、百日咳毒素（PT）及菌毛而生產了一種基本上沒有內毒素（ET）（其為引起發燒等不良反應的主要因素）的無細胞百日咳疫苗（ACP疫苗），并已在臨床上付諸使用。

生產ACP疫苗的最關鍵性步驟是從抗感染部分中分離出內毒素（ET），而為此目的已普遍使用了蔗糖梯度離心法（日本未審查專利公開57-50925號，即相當于EPC公開0047802號）。

此外，作為一種除去熱原的技術，已知有使用磷酸鈣凝膠的方法（日本專利公開34-2149號）。也知道羥基磷灰石凝膠-磷酸鈣凝膠的一種穩定化變體，在從百日咳毒素（PT）中分離菌絲血凝素（FHA）上是有效的，而且已知可在羥基磷灰石凝膠柱上由百日咳毒素中層析分離出無內毒素（或基本上無內毒素）的菌絲血凝素，并可經親合層析和蔗糖梯度離心進一步純化之（Japanese????Journal????of????Bacteriology，38（1），423，1983）。

單用蔗糖梯度離心法雖然能除去99.995%的內毒素（ET），但作為含抗感染部分的液體粗提物，其仍富含內毒素（ET），可見很難將保護性部分與內毒素（ET）完全分離開，而且抗感染部分的產率也不高。再者，因為生產體積小而且成本高耗時多，所以這種方法不能夠滿足商業化生產的需要。

另一方面，單用磷酸鈣凝膠處理只能保證達到90～99.9%的低內毒素排除率，因此沒有什么實用價值。聯合使用羥基磷灰石柱層析、親合層析及蔗糖梯度離心方法，有可能在實驗室水平上在與百日咳毒素（PT）的分離中分離和純化出完全沒有內毒素的菌絲血凝素（FHA），但這種方法所獲產品的產量卻不能符合商品化生產的要求。此外，所涉及的技術在目的上，亦不同于本發明由含有保護性部分及內毒素（ET）的液體除去內毒素（ET）這一發明目的。

與上述技術背景不同，我們則是探索除去內毒素（ET）的有效方法，并發現在進行蔗糖梯度離心之前先用磷酸鈣凝膠處理，可以很徹底地將保護性部分與內毒素（ET）分離開，而且可經蔗糖梯度離心進一步提高產量和內毒素（ET）的清除率。針對這些發現作進一步的研究，最后確立了本發明。

因此本發明提供了（1）一種經區域離心由含有I期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染性部分和內毒素的液體中除去內毒素的方法，特征在于于區域離心前在過量磷酸跟離子存在下向所說的液體內加入鈣離子，并棄去所形成的沉淀;（2）一種生產百日咳類毒素的方法，特征在于對依照上述方法制得的含抗感染部分的液體作解毒處理;以及（3）一種其內毒素含量為每10μg蛋白氮不超過0.5ng的百日咳類毒類。

使用本發明的除去百日咳內毒素的方法，可以使從內毒素中分離抗感染部分的工作做得更為肯定和徹底，結果是能比較容易地以更高收率分離到保護性部分。此外，因為可進行區域離心的原料量大并能以高效率除去內毒素，從而可使百日咳類毒素的產量增加兩倍以上。因此，本發明的工業價值是很大的。

再者，與以常規方法生產的類毒素相比，依據本發明的方法生產的百日咳類毒素中內毒素含量不超過前者的十分之一，而且使用本發明的百日咳類毒素能在工業水平上生產出與常規疫苗有同樣免疫學作用的疫苗，且降低了產品的毒性。

前述含I期百日咳博德特氏菌菌株之抗感染部分和內毒素的液體，例如可以是經培養I期百日咳博德特氏菌菌株所得培養物的上清液或其濃縮液，且最好是濃縮液。可依照常規方法培養I期百日咳博德特氏菌的菌株。例如，可使微生物在液體培養基（如Cohen-Wheeler培養基或Stainer-Scholte培養基）中于35-37℃下生長約5-7天。可用過濾或離心方法收集如此得到的培養物的上清液。可直接或于濃縮后，對上清液作進一步處理以除去內毒素。為此目的，可用已知的鹽析技術進行濃縮。例如，可將2至5kg硫酸銨加到各10升培養物上清液中，并用過濾或離心等方法收集所產生的沉淀物。然后將該沉淀物溶解在適當量的1M氯化鈉-0.05M磷酸鹽緩沖液中，并以離心或其他方法處理溶液，以分離上清液。